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肥猫p

木虫 (正式写手)

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虫号: 1709733

[交流] NEB酶切产物纯化回收率很低

当质粒进行单酶切或者只切除很小的片段时，我会直接使用PCR清洁试剂盒对酶切产物进行柱回收。
在原来实验室，我用的TAKARA的内切酶和Axygen的PCR清洁试剂盒，回收率很高，一般>80%.
最近换了实验室，现在使用NEB的内切酶，酶切产物我试过生工和Axygen清洁试剂盒来回收，但是效率都很低，不超过20%。
我试过加入多倍的高盐低pH缓冲液，挂柱子时低速离心，wash buffer（已加乙醇）洗脱后空离，加热洗脱液，EB buffer或ddH2O润湿硅胶柱后静置再离心，等方法，但回收率并没有明显的提高。
PCR清洁试剂盒质量没有问题，回收PCR产物时，回收率很高。
这个是NEB的Cutsmart buffer 的成分，我觉得也没有什么特别的地方，很不理解为什么回收率会这么低。不知大家是否有遇到类似状况，是如何解决的呢？谢谢
50 mM Potassium Acetate
20 mM Tris-acetate
10 mM Magnesium Acetate
100 μg/ml BSA
pH 7.9@25°C

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朱云凯

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1楼 2017-10-28 21:57:56

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陌笙石上菁

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 17679714

★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与

我现在也遇到了这个问题。用的NEB的酶，按照官网提示的双酶切反应体系，1ug的质粒，BamHI和KpnI各1ul，10×的NEBbuffer 1.1 5ul,50ul的体系，其余用ddH2O补齐。质粒提出来130ng/ul，但是酶切完用Axygen试剂盒纯化只有10以内，还有的40多但是有很多杂峰。我师姐跟我说是我体系里的质粒量太少了，50ul体系里有35.5的水，最后吸附在柱子上的肯定也少。我看文献里用的是TAKARA的酶和赛默飞的酶，但是体系也是这样的，不知道问题出在哪了。如果楼主解决了烦请跟我说一声