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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » NEB酶切产物纯化回收率很低
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肥猫p

木虫 (正式写手)

[交流] NEB酶切产物纯化回收率很低

当质粒进行单酶切或者只切除很小的片段时，我会直接使用PCR清洁试剂盒对酶切产物进行柱回收。
在原来实验室，我用的TAKARA的内切酶和Axygen的PCR清洁试剂盒，回收率很高，一般>80%.
最近换了实验室，现在使用NEB的内切酶，酶切产物我试过生工和Axygen清洁试剂盒来回收，但是效率都很低，不超过20%。
我试过加入多倍的高盐低pH缓冲液，挂柱子时低速离心，wash buffer（已加乙醇）洗脱后空离，加热洗脱液，EB buffer或ddH2O润湿硅胶柱后静置再离心，等方法，但回收率并没有明显的提高。
PCR清洁试剂盒质量没有问题，回收PCR产物时，回收率很高。
这个是NEB的Cutsmart buffer 的成分，我觉得也没有什么特别的地方，很不理解为什么回收率会这么低。不知大家是否有遇到类似状况，是如何解决的呢？谢谢
50 mM Potassium Acetate
20 mM Tris-acetate
10 mM Magnesium Acetate
100 μg/ml BSA
pH 7.9@25°C
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朱云凯

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1楼 2017-10-28 21:57:56
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朱云凯

银虫 (初入文坛)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
送红花一朵
你好，请问你的问题解决了吗？最近我也遇到这样的问题，真心头疼，需要你的建议，谢谢！
赞一下 回复此楼
24楼2020-03-26 01:16:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
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小阳sunny

新虫 (初入文坛)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
NEB的酶，我们实验室一直在用，因为他的buffer 能够兼容很多种酶，觉得效果还不错。没有发现是因为用NEB酶导致回收率低的

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3楼2017-10-28 23:01:19
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王查查23

禁虫 (小有名气)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
7楼2017-10-28 23:24:18
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nono20092楼
2017-10-28 23:00   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
Lucyjuly7294楼
2017-10-28 23:17   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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Lucyjuly7295楼
2017-10-28 23:18   回复  
远方的游子6126楼
2017-10-28 23:24   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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M塞北8楼
2017-10-28 23:35   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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塞北先生9楼
2017-10-28 23:43   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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spc0812楼
2017-10-29 00:10   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
tpw12313楼
2017-10-29 00:24   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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ylheping14楼
2017-10-29 07:51   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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