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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 以提取的基因组为模板，使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR无果，求助各位大神
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长大的小鱼93

新虫 (小有名气)

[求助] 以提取的基因组为模板，使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR无果，求助各位大神 已有4人参与

筛选到一株含有目的酶的菌株，使用NCBI查找到目的酶的基因，以提取的基因组为模板，使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR均未果。期间重新设计过引物，进行过梯度PCR但都没有结果，且每次跑胶结果都特别干净，没有任何条带。实验新手一枚，现在请问各位大神有没有遇到过这种情况？是不是可以用Taq酶进行一下PCR，但我是要PCR获得目的基因送测序，怕Taq酶保真性不高有突变。希望大家可以给出一些建议，一些我可以继续的尝试，谢谢大家了!
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1楼 2017-10-09 20:24:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom
基因组用纯水稀释10或100倍试试，基因组中残留酚氯仿影响pcr

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长大的小鱼93 长大的小鱼93
只要有梦想，坚持就一定能实现
2楼2017-10-09 21:09:06
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普通回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-10-11 07:44:35
primerstar扩增不出来，是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性，而普通的Taq酶没有， 所以Taq酶能扩出来的，primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好，不会出现primerstar的 情况而且大于普通酶的 灵敏度和特异性，值得 一试。如果扩增片段大于15kb的话，推荐长扩增聚合酶，下游实验对精确度要求很高的话，建议使用 具有 保真性的高保真酶。
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长大的小鱼93
及时行乐，人生不留遗憾！
3楼2017-10-09 21:17:05
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长大的小鱼93

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试，基因组中残留酚氯仿影响pcr

好的，谢谢建议，明天试试
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4楼2017-10-09 21:52:30
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长大的小鱼93

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-09 21:17:05
primerstar扩增不出来，是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性，而普通的Taq酶没有， 所以Taq酶能扩出来的，primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好，不会出现primerstar的 情况而且大于普 ...

谢谢，请问primerstar可以将引物或是模板降解还是第一次听说，可以具体解释一下吗，万分感谢；会试一试用taq酶进行PCR，日后有问题还请多多指教，谢谢！
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5楼2017-10-09 21:57:47
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用taq酶扩增试试，primerStar对模板要求比较高……

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不是优秀，而是不可替代
6楼2017-10-09 22:54:32
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egexig

新虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2017-10-11 07:44:51
我也有一段目的基因，用基因组作为模板怎么都行不通，换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没？
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7楼2017-10-10 10:04:04
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luckydog52

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试，基因组中残留酚氯仿影响pcr

这问题我也遇到过，稀释之后确实扩出来了

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自信源于一次次成功的积累
8楼2017-10-10 12:06:33
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长大的小鱼93

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因，用基因组作为模板怎么都行不通，换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没？

还没解决呢，现在正在一点点尝试，咨询大家的建议
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9楼2017-10-10 14:24:31
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom
是不是基因组上没有你要的基因，基因组有问题，基因片段短的话用菌液为模版都能P出来

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只要有梦想，坚持就一定能实现
10楼2017-10-10 14:33:23
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