24小时热门版块排行榜    

查看: 2588  |  回复: 15

长大的小鱼93

新虫 (小有名气)

[求助] 以提取的基因组为模板,使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR无果,求助各位大神 已有4人参与

筛选到一株含有目的酶的菌株,使用NCBI查找到目的酶的基因,以提取的基因组为模板,使用PrimerSTAR酶对目的基因进行PCR均未果。期间重新设计过引物,进行过梯度PCR但都没有结果,且每次跑胶结果都特别干净,没有任何条带。实验新手一枚,现在请问各位大神有没有遇到过这种情况?是不是可以用Taq酶进行一下PCR,但我是要PCR获得目的基因送测序,怕Taq酶保真性不高有突变。希望大家可以给出一些建议,一些我可以继续的尝试,谢谢大家了!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr

发自小木虫IOS客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

只要有梦想,坚持就一定能实现
2楼2017-10-09 21:09:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-10-11 07:44:35
primerstar扩增不出来,是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性,而普通的Taq酶没有, 所以Taq酶能扩出来的,primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好,不会出现primerstar的 情况而且大于普通酶的 灵敏度和特异性,值得 一试。如果扩增片段大于15kb的话,推荐长扩增聚合酶,下游实验对精确度要求很高的话,建议使用 具有 保真性的高保真酶。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

及时行乐,人生不留遗憾!
3楼2017-10-09 21:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

长大的小鱼93

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr

好的,谢谢建议,明天试试
4楼2017-10-09 21:52:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

长大的小鱼93

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-09 21:17:05
primerstar扩增不出来,是因为它具有将你的引物或者模板讲解的 可能性,而普通的Taq酶没有, 所以Taq酶能扩出来的,primerstar不一定能扩出来,而热启动Taq聚合酶扩增性能很好,不会出现primerstar的 情况而且大于普 ...

谢谢,请问primerstar可以将引物或是模板降解还是第一次听说,可以具体解释一下吗,万分感谢;会试一试用taq酶进行PCR,日后有问题还请多多指教,谢谢!
5楼2017-10-09 21:57:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
先用taq酶扩增试试,primerStar对模板要求比较高……

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
6楼2017-10-09 22:54:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

egexig

新虫 (初入文坛)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2017-10-11 07:44:51
我也有一段目的基因,用基因组作为模板怎么都行不通,换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没?
7楼2017-10-10 10:04:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luckydog52

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by flhua at 2017-10-09 21:09:06
基因组用纯水稀释10或100倍试试,基因组中残留酚氯仿影响pcr

这问题我也遇到过,稀释之后确实扩出来了

发自小木虫Android客户端
自信源于一次次成功的积累
8楼2017-10-10 12:06:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

长大的小鱼93

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by egexig at 2017-10-10 10:04:04
我也有一段目的基因,用基因组作为模板怎么都行不通,换了好多引物都不行。相同基因其他位点都p出来了。
楼主最后解决了没?

还没解决呢,现在正在一点点尝试,咨询大家的建议
9楼2017-10-10 14:24:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

是不是基因组上没有你要的基因,基因组有问题,基因片段短的话用菌液为模版都能P出来

发自小木虫IOS客户端
只要有梦想,坚持就一定能实现
10楼2017-10-10 14:33:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 长大的小鱼93 的主题更新
信息提示
请填处理意见