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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！
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cifer1230

金虫 (著名写手)

[交流] q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！

我普通pcr摸出条带的，做q的时候退火温度也总是不合适，一次次的摸，结果都不太好，总有引物二聚体，我都不知道退火温度咋整了，试着从引物合成报告上减3-5度，也试过用从NCBI上blast的退火温度，都没有好的结果，乱七八糟的，因为刚刚接触，我认为这样盲做也不是办法，想请教下大家。
以下是我最近做的实验，我都快崩溃了，求帮帮忙。
我的引物是生工合成的，纯化程度是ULTRAPAGE
BETA:退火温度分别是，53.4，54.6. BLAST结果是：57
fyn:退火温度分别是55.56,55.75.BLAST结果是：60
这次的实验用的温度是blast的退火温度，结果如下，惨不忍睹。
求各位有经验者指出我的问题，我将不胜感激。
还有我做的是两个引物的标准曲线

q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！
AMPLIFICATION.png


q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！-1
CMD.png


q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！-2
MELT CURVE.png


q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！-3
STANDARD CURVE.png


q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！-4
标准曲线.png


q-pcr总是做不出来，我真是要死了，谁来拯救下我！！！-5
程序.png
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1楼 2017-09-25 09:12:19
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笑纳人生

新虫 (初入文坛)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
我之前也是老是出现这种问题，做了很多无用功，后来发现是引物的问题，引物买来之后没有保存好，每次扩增出来都是乱七八糟的，重新合成了引物之后就没有问题了，祝好
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5楼2017-09-29 21:36:58
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笑纳人生 at 2017-09-29 21:36:58
我之前也是老是出现这种问题，做了很多无用功，后来发现是引物的问题，引物买来之后没有保存好，每次扩增出来都是乱七八糟的，重新合成了引物之后就没有问题了，祝好

你说的引物没有保存好，是什么意思？我的引物就是放在-20℃，别的还需要怎样，我最近也在重新设计引物，都不知道咋整了？
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6楼2017-09-30 08:59:27
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vivianhu0123

新虫 (初入文坛)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
关于退火温度，BLAST上给的只是参考值，建议你做一个gradient PCR 去确定合适的退火温度 建议55-65
关于标准曲线，从参数上看beta还行，只是R2有点低，一般在0.99左右最好。而fyn1建议重做，或者看看是否有multiple bands。
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10楼2017-10-14 03:54:32
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山还在那儿

银虫 (小有名气)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
先做个NTC(无模板对照），如果还是出现非特异性扩增，检查试剂是否污染，若污染则是引物设计的问题，祝好！
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3楼2017-09-25 10:04:19
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 山还在那儿 at 2017-09-25 10:04:19
先做个NTC(无模板对照），如果还是出现非特异性扩增，检查试剂是否污染，若污染则是引物设计的问题，祝好！

嗯嗯
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4楼2017-09-25 10:49:43
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 笑纳人生 at 2017-09-29 21:36:58
我之前也是老是出现这种问题，做了很多无用功，后来发现是引物的问题，引物买来之后没有保存好，每次扩增出来都是乱七八糟的，重新合成了引物之后就没有问题了，祝好

你说的引物没有保存好，是什么意思？我的引物就是放在-20℃，别的还需要怎样，我最近也在重新设计引物，都不知道咋整了？
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7楼2017-09-30 09:12:17
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
引物的问题比较大，导致扩增效率不够，环境也可能存在污染（CT值才在20几梯度就拉不开了），你的片段是多长的？最好小于150bp
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8楼2017-09-30 12:51:11
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by vege的桌子 at 2017-09-30 12:51:11
引物的问题比较大，导致扩增效率不够，环境也可能存在污染（CT值才在20几梯度就拉不开了），你的片段是多长的？最好小于150bp

目的片段225，内参的176.太大了？？？
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9楼2017-10-05 21:41:10
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by vivianhu0123 at 2017-10-14 03:54:32
关于退火温度，BLAST上给的只是参考值，建议你做一个gradient PCR 去确定合适的退火温度 建议55-65
关于标准曲线，从参数上看beta还行，只是R2有点低，一般在0.99左右最好。而fyn1建议重做，或者看看是否有multipl ...

嗯嗯，谢谢您
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11楼2017-10-14 09:08:32
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张at

新虫 (正式写手)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
祝你好运

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12楼2017-10-16 11:01:14
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暖暖的太阳花

新虫 (初入文坛)
★
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
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3楼: Originally posted by 山还在那儿 at 2017-09-25 10:04:19
先做个NTC(无模板对照），如果还是出现非特异性扩增，检查试剂是否污染，若污染则是引物设计的问题，祝好！

请问无模板对照什么意思，不加模板的话不就没有峰了吗，谢谢

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13楼2017-10-18 22:36:44
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vivianhu0123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 暖暖的太阳花 at 2017-10-18 22:36:44
请问无模板对照什么意思，不加模板的话不就没有峰了吗，谢谢
...

就是要看看有没有峰，理论上是没有峰，如果你的试剂污染就会出现峰，那就要换试剂了。
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14楼2017-10-19 01:46:53
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暖暖的太阳花

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by vivianhu0123 at 2017-10-19 01:46:53
就是要看看有没有峰，理论上是没有峰，如果你的试剂污染就会出现峰，那就要换试剂了。...

好的，知道了，谢谢

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15楼2017-10-19 07:55:23
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匿名

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cifer1230(金币+1): 谢谢参与
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16楼2018-01-19 15:33:54
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匿名

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17楼2018-01-19 15:34:44
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by ychmax at 2018-01-19 15:33:54
看你的溶解曲线觉得是引物问题，建议换引物，可以去primerbank 有现成的

我的是大鼠，primerbank里面只有人和小鼠的

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18楼2018-01-19 15:37:29
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匿名

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19楼2018-01-19 15:55:53
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cifer1230

金虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by ychmax at 2018-01-19 15:55:53
那就重新设计吧，一般设计好的引物，我都选择退货温，用仪器自带去跑都没问题。同时你用的试剂质量很重要，最好是进口的
...

嗯嗯，我想问下，您的引物设计用的什么软件，会blast吗？

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20楼2018-01-19 16:12:49
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匿名

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★ ★
cifer1230: 金币+2 2018-01-20 14:05:42
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21楼2018-01-19 19:50:30
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刘星宇

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
http://muchong.com/t-3234286-1
认真阅读这个帖子里的资料，问题好解决。
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22楼2018-01-24 17:03:43
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这有引物二聚体  重新设计引物吧
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23楼2018-01-30 11:38:31
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chenshasha“

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到这样的情况  同求大神相助！
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24楼2018-08-06 10:03:25
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朝都2楼
2017-09-25 09:22   回复  
cifer1230(金币+1): 谢谢参与
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