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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 双荧光素酶报告实验，24孔板，质粒比例及总量，还有miRNA类似物共转染等问题
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子

[求助] 双荧光素酶报告实验，24孔板，质粒比例及总量，还有miRNA类似物共转染等问题 已有3人参与

楼主小白一枚，在做双荧光素酶报告实验。

一： 肺癌细胞292，铺的24孔板，铺板前没计数，隔天镜检，细胞密度有点低，应该不到90%左右，可以再等一天转染不？


二：实验载体与海肾荧光素载体的比例多少合适呢？另外miRNA类似物加多少量？   


三：DNA的总量是加上miRNA类似物的嘛？


四：DNA总量与lipo2000的比例？


五：铺板用的培养基是含有抗生素的，转染前PBS清洗，这个影响大不大？ 转染前需要不需要细胞饥饿处理？


六：24孔板无血清无抗培养基500 uL ＋ 稀释质粒与稀释lipo2000的体积，终体积有多少？


问题比较多，请诸位做过的大神予以指点。
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麻辣王子不爱做实验
1楼 2017-08-30 13:50:16
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
查了好多资料，也没搞太清楚明白。百度文库中相关知识的就不要回复到这里了。
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麻辣王子不爱做实验
2楼2017-08-30 13:52:16
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那片海dm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zht930528: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-08-30 15:12:13
一般都是铺板24h之内转染，时间长了不好转，DNA和Lip2000的比例Lip2000说明书上有，不同厂家的应该不一样，铺板时不要加抗生素会影响转染效率的
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3楼2017-08-30 14:59:18
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
引用回帖:
3楼: Originally posted by 那片海dm at 2017-08-30 14:59:18
一般都是铺板24h之内转染，时间长了不好转，DNA和Lip2000的比例Lip2000说明书上有，不同厂家的应该不一样，铺板时不要加抗生素会影响转染效率的

铺的板24h后细胞密度确实不太高，50%左右的样子，细胞按理来讲24h与48h应该都是处在对数期，转染应该差不多的吧，我不是很清楚这个原因。 另外铺板时添加了抗生素，后边用PBS与无血清无抗培养基洗涤应该除的去抗生素的，我不是很理解这个影响有这么大吗？
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麻辣王子不爱做实验
4楼2017-08-30 15:16:02
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那片海dm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zht930528 at 2017-08-30 15:16:02
铺的板24h后细胞密度确实不太高，50%左右的样子，细胞按理来讲24h与48h应该都是处在对数期，转染应该差不多的吧，我不是很清楚这个原因。 另外铺板时添加了抗生素，后边用PBS与无血清无抗培养基洗涤应该除的去抗生 ...

之前我铺的细胞如果24h没长满师姐都让我重新铺，而且我们铺板都是没加抗生素的，也不知道加了之后用PBS洗会不会有影响
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zht930528
5楼2017-08-30 15:22:28
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阳光zh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zht930528: 金币+45, ★★★很有帮助, 跟楼下平分吧~~谢谢回复！ 2017-11-29 17:17:26
一：转染实验一般在传代后12~24 h进行，Dual-Luciferase实验的话细胞密度达到70~80%就可以了

二：Firefly与Renilla转染量的比值是要自己摸索的，因为Renilla是CMV的强启动子，而Firefly的启动子随具体实验而定，我之前有做过5：1的，也有10：1的，这个做下预实验就可以大概知道了，一般FL和RL的值测出来都在10的4次方以上。

三：建议分开转染


四：根据细胞的转染是否容易而定，一般1：1或者1：2，Lipo2000具有一定的毒性，加多了损伤细胞


五：PBS洗的时候不要把细胞洗掉就行了，建议铺板时就用无双抗的培养基。是否需要饥饿处理由具体实验而定。


六：24孔板一般加1 mL培养基，Opti-MEM和Lipo2000的量根据质粒而定，我之前转染500 ng质粒，100 uL Opti-MEM，1 uL Lipo2000.（供参考）
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zht930528
6楼2017-08-30 16:53:46
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ywwabc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zht930528: 金币+45, ★★★很有帮助, 跟楼上评分吧~~嘿嘿~ 2017-11-29 17:20:19
1、        细胞密度转染时不要太多，如果转入的基因明显抑制增殖还好，如果影响不大的话70%就可以（还要看细胞的增长速度），毕竟你转染后细胞还是要增殖的，过了对数生长期，细胞表达能力就下降了
2、        实验载体与海肾荧光素载体的比例是1:1，我共转时实验载体、海肾荧光素载、miRNA就是正常情况下的一半，三个共转，那就是平时的1/3；
3、        同上
4、        一般是我24孔质粒单转是2ug，lip2000是2-2.5ul，miRNA是2.5-5ul（义翘的），共转时就按共转的比例下降就可以了
5、        抗生素影响不大，可以清洗，最好饥饿2h,LIP2000有毒，所以转染6h左右最好换液
6、        稀释质粒与稀释lipo2000的共体积50到100ul就够了，这个没什么要求的，只要每组实验处理一样就可以了
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7楼2017-08-31 16:22:47
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
谢谢各位回复，将自己做实验过程中参考的一些文档上传，有需要的可 参考下~ 主要都是Thermo Fisher 与Promega 的说明书。

链接: https://pan.baidu.com/s/1hrPwE3M 密码: ydwg
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麻辣王子不爱做实验
8楼2017-11-29 17:12:25
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 那片海dm at 2017-08-30 15:22:28
之前我铺的细胞如果24h没长满师姐都让我重新铺，而且我们铺板都是没加抗生素的，也不知道加了之后用PBS洗会不会有影响...

抗生素对细胞影响很大，铺板密度依据不同细胞种类与实验目的可以自由调整，不过细胞密一点可以抵抗转染试剂的毒性；由于实验室条件有限，为了防止染菌，采用了添加双抗，不过转染前用无抗无血清培养基润洗一遍，转染时采用无抗无血清培养基培养，转染效率也是还可以的； 转染后如果有换液的步骤的话，一定要换无抗的培养基。个人实验过程中的一点见解。
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麻辣王子不爱做实验
9楼2017-11-29 17:16:03
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zht930528

木虫 (正式写手)

麻辣王子
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 阳光zh at 2017-08-30 16:53:46
一：转染实验一般在传代后12~24 h进行，Dual-Luciferase实验的话细胞密度达到70~80%就可以了

二：Firefly与Renilla转染量的比值是要自己摸索的，因为Renilla是CMV的强启动子，而Firefly的启动子随具体实验而定， ...

谢谢回复！其中第三条：有做miRNA的话 mimics 与质粒得共转染啦；第五：如果铺板用了双抗，转染前用无抗无血清培养基或PBS洗一下，转染效率其实还可以~ 另外：Lipo 2000 如果储存不当，一定就不要用了...会把细胞都搞死去  个人实验过程一点见解，欢迎批评！
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麻辣王子不爱做实验
10楼2017-11-29 17:19:57
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