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zht930528木虫 (正式写手)
麻辣王子
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[求助]
双荧光素酶报告实验，24孔板，质粒比例及总量，还有miRNA类似物共转染等问题 已有3人参与
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楼主小白一枚，在做双荧光素酶报告实验。 一： 肺癌细胞292，铺的24孔板，铺板前没计数，隔天镜检，细胞密度有点低，应该不到90%左右，可以再等一天转染不？ 二：实验载体与海肾荧光素载体的比例多少合适呢？另外miRNA类似物加多少量？ 三：DNA的总量是加上miRNA类似物的嘛？ 四：DNA总量与lipo2000的比例？ 五：铺板用的培养基是含有抗生素的，转染前PBS清洗，这个影响大不大？ 转染前需要不需要细胞饥饿处理？ 六：24孔板无血清无抗培养基500 uL ＋ 稀释质粒与稀释lipo2000的体积，终体积有多少？ 问题比较多，请诸位做过的大神予以指点。 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
zht930528: 金币+45, ★★★很有帮助, 跟楼上评分吧~~嘿嘿~ 2017-11-29 17:20:19
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zht930528: 金币+45, ★★★很有帮助, 跟楼上评分吧~~嘿嘿~ 2017-11-29 17:20:19
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1、 细胞密度转染时不要太多，如果转入的基因明显抑制增殖还好，如果影响不大的话70%就可以（还要看细胞的增长速度），毕竟你转染后细胞还是要增殖的，过了对数生长期，细胞表达能力就下降了 2、 实验载体与海肾荧光素载体的比例是1:1，我共转时实验载体、海肾荧光素载、miRNA就是正常情况下的一半，三个共转，那就是平时的1/3； 3、 同上 4、 一般是我24孔质粒单转是2ug，lip2000是2-2.5ul，miRNA是2.5-5ul（义翘的），共转时就按共转的比例下降就可以了 5、 抗生素影响不大，可以清洗，最好饥饿2h,LIP2000有毒，所以转染6h左右最好换液 6、 稀释质粒与稀释lipo2000的共体积50到100ul就够了，这个没什么要求的，只要每组实验处理一样就可以了 |
7楼2017-08-31 16:22:47
zht930528
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2楼2017-08-30 13:52:16
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zht930528
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4楼2017-08-30 15:16:02
25