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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 哇，T4连接不上，难受
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

[交流] 哇，T4连接不上，难受 已有5人参与

我需要把大约1-2K的片段插入酵母双杂的AD载体上。。。。片段和载体双酶切回收的，nanodrop测的浓度载体50多ng 片段20多ng.然后用的promega  T4过夜连接，自己做的DH5α。转化后板子上一个不长。。很难受，块两个月了。求好心人指导指导。。。

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1楼 2017-08-02 11:48:26
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
哇，没人吗

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2楼2017-08-02 16:30:18
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zyfskj

新虫 (著名写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-03 07:43:46
首先呢，一个转化子不长，你不妨先转个空载体进去看看你的感受态长不长的出来，从而确认感受态有没有问题，再就是你的抗性标记没搞错吧。

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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
3楼2017-08-02 16:56:00
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
丢给我做吧~~~patpat~~
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4楼2017-08-02 18:56:46
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-08-02 18:56:46
丢给我做吧~~~patpat~~

额。。。求指导。

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5楼2017-08-02 21:59:24
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
★
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板子上一个不长，无非是3个原因：

1.载体没构好：调节载体和片段的比例，确认T4连接酶有活性。
2. 感受态不行，自己做的感受态效率比商品的低太多，还是买商品的吧，我之前就是在这步上想省，结果浪费好多时间。BL21之类的直接转质粒的感受态可以自己制备，因为比较容易。。。
3.板子抗性不对。虽然低级，但是真的有可能犯。。。。。
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6楼2017-08-06 17:39:01
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gongrui

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议可以用同源重组连接试一下。

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7楼2017-08-06 18:07:10
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)
★
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载体、连接产物、感受态，，一个一个排除。。
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8楼2017-08-07 08:44:18
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gongrui at 2017-08-06 18:07:10
建议可以用同源重组连接试一下。

老哥，用了同源重组。。板子上一个菌不长

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9楼2017-08-08 08:42:47
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 极北小白熊 at 2017-08-07 08:44:18
载体、连接产物、感受态，，一个一个排除。。

哎。。。。感受态老师不让买

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10楼2017-08-08 08:43:57
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