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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

[交流] 哇,T4连接不上,难受 已有5人参与

我需要把大约1-2K的片段插入酵母双杂的AD载体上。。。。片段和载体双酶切回收的,nanodrop测的浓度载体50多ng 片段20多ng.然后用的promega  T4过夜连接,自己做的DH5α。转化后板子上一个不长。。很难受,块两个月了。求好心人指导指导。。。

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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

2楼2017-08-02 16:30:18
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zyfskj

新虫 (著名写手)

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-03 07:43:46
首先呢,一个转化子不长,你不妨先转个空载体进去看看你的感受态长不长的出来,从而确认感受态有没有问题,再就是你的抗性标记没搞错吧。

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向我乞求怜悯吧,我会狠狠拒绝的。
3楼2017-08-02 16:56:00
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
丢给我做吧~~~patpat~~
4楼2017-08-02 18:56:46
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-08-02 18:56:46
丢给我做吧~~~patpat~~

额。。。求指导。

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5楼2017-08-02 21:59:24
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Ivy尘

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
板子上一个不长,无非是3个原因:

1.载体没构好:调节载体和片段的比例,确认T4连接酶有活性。
2. 感受态不行,自己做的感受态效率比商品的低太多,还是买商品的吧,我之前就是在这步上想省,结果浪费好多时间。BL21之类的直接转质粒的感受态可以自己制备,因为比较容易。。。
3.板子抗性不对。虽然低级,但是真的有可能犯。。。。。
6楼2017-08-06 17:39:01
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gongrui

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议可以用同源重组连接试一下。

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7楼2017-08-06 18:07:10
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极北小白熊

铁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
载体、连接产物、感受态,,一个一个排除。。
8楼2017-08-07 08:44:18
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gongrui at 2017-08-06 18:07:10
建议可以用同源重组连接试一下。

老哥,用了同源重组。。板子上一个菌不长

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9楼2017-08-08 08:42:47
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化蝶为谁舞

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 极北小白熊 at 2017-08-07 08:44:18
载体、连接产物、感受态,,一个一个排除。。

哎。。。。感受态老师不让买

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10楼2017-08-08 08:43:57
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