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电转影响因素及原理 已有3人参与
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影响电转的因素及如何影响的，已经电转了很多次还是没有克隆长出来，想了解下一些影响因素及原理，然后好去继续实验 发自小木虫Android客户端 |
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嗯嗯。因为近期也做过用到感受态的实验，也成功了，感受态应该是没什么问题的。电转步骤我列一下吧。(无菌操作) 1.取出放在-80℃冰箱的80μ感受态室温放置20-30分钟后加入8μ的质粒 2.静置20-30分钟 3.加入电转杯(提前酒精消毒电转杯，无气泡) 4.点击2100v 25μF 100Ω 5.加入37℃预热的培养基 6.培养 发自小木虫Android客户端 |
6楼2017-08-02 09:28:32
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+6, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2017-08-02 07:45:31
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西门吹雪170: 金币+6, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2017-08-02 07:45:31
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电转原理： 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/礸 DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态‘，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/礸 DNA。 影响因素： ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、质粒dna的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 ⑶、试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。 ⑷、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 ⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 |
2楼2017-08-01 22:38:46
3楼2017-08-01 23:23:46
上一条不小心发出去了 一楼CaCl2都出来了 这是电转 哪来的CaCl2啊 讲道理电转的效率一般情况下很高 楼主最好把感受态制备和电转流程写一下 这样便于别人找问题在哪里哦 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2017-08-01 23:26:32
