应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因
381/4返回列表1234下一页
查看: 2765  |  回复: 37
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

badronger

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因 已有3人参与

利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因，但在第一步就花了两个月都没做出来，急！！！

我是直接用的别人构建好的质粒，这个质粒上原本就是20nt，我得要把这20nt置换下来，连接上我自己的20nt，我是用酶切的方式（此质粒文献中的方法），但是这个酶是BaeI酶，这个酶比较特殊而且酶切效率不是很高。目前遇到的最大问题是，我的负对照（酶切后的质粒做连接转化，没有我的20nt）和我的实i验组长出的板子单克隆很奇怪，是那种像针尖一样，硬的，透明的很小的单克隆，很难挑。但是也能摇出菌，可是经测序是原始质粒。
我目前最大困惑：
（1）就是为什么负对照和实验组（有我自己设计的20nt）长出的单克隆形态与原始质粒的单克隆（正常的大杆菌单克隆形态）非常不一致。
（2）虽说有可能是酶切效率不高，导致挑了很多单克隆都不是。但是我没切时间有8小时，我感觉足够长了，是不是BaeI这个酶太特别了

希望大神能帮忙一下，快三个了，没一点进展，老师逼得急啊
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2017-07-22 19:43:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-21 11:54:51
我怎么记得，Crispr的质粒，连上了别人的sgRNA之后，就不能替下来连自己的呢。。。必须要用空载切才行哎。。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2017-07-22 21:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by badronger at 2017-07-24 14:59:18
什么叫做空载切啊？卧室先酶切把别人的20bp切下来了，然后再连自己的20bp，这样不可以吗？
...

印象中不可以，因为别人连他的20bp的时候，就已经把酶切位点破坏掉了。你再切切不开。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2017-07-24 20:14:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有原始序列吗？可以在酶切设计的时候，考虑周全了，看看是否破坏酶切序列
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2017-07-25 10:31:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

badronger

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-07-22 21:12:13
我怎么记得，Crispr的质粒，连上了别人的sgRNA之后，就不能替下来连自己的呢。。。必须要用空载切才行哎。。

什么叫做空载切啊？卧室先酶切把别人的20bp切下来了，然后再连自己的20bp，这样不可以吗？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2017-07-24 14:59:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

草溪河

铁虫 (著名写手)
请仔细分析这个酶的特点，识别序列

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2017-07-28 18:33:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

davidck

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-08-21 11:55:29
原因可能是模板没有去除干净；酶连接效率太低；导致最后的克隆都是阴性的。
你可以：
1. 最简单的做法，让公司去做。现在很多公司都接这种活儿。
2. 利用PCR的方法，将模板的20bp取代掉，然后dpnI酶将模板处理干净，这样可能效果会好些。但是也不排除还是存在假阳性。

另外，请教下关于链霉菌遗传操作的事情，最近打算做相关工作，但是从没做过。可以互相交流。
如有意，私信我你的联系方式。
赞一下 回复此楼
7楼2017-08-14 16:09:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

易化星
8楼2017-08-17 16:19:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

灵象雪
9楼2017-08-17 16:29:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

易化星
10楼2017-08-17 22:04:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 badronger 的主题更新
381/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 河北省自然科学基金 +5 Peterchao 2026-05-18 8/400 2026-05-24 11:58 by 晓晓爱翠翠
[基金申请] 西安交大新媒学院副院长用撤稿论文结题 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:16 by kudofaye
[教师之家] 某211大学教师把个人教师官方主页改成:我跑了我跑了我跑了!官宣跑路！ +4 zju2000 2026-05-21 5/250 2026-05-24 09:35 by songwz
[考博] 26/27申博自荐 10+4 ZXW0202 2026-05-22 9/450 2026-05-24 08:47 by bjvtcliu
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hvkbtfonbv 2026-05-23 3/150 2026-05-24 08:01 by 9ps9vgkqva
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 pmo95bazuy 2026-05-23 7/350 2026-05-24 06:35 by fpo5ljpv91
[基金申请] 揭秘青基评审内幕：几个A才能顺利中标 +3 国自然国社科中 2026-05-23 4/200 2026-05-23 15:37 by 2000zf36392
[基金申请] 青B发送上会通知了吗 +5 chemBioBro 2026-05-22 7/350 2026-05-23 12:35 by zhuifengzhy
[考博] 博士申请 +3 焦晓明 2026-05-21 3/150 2026-05-23 11:26 by mlc840311
[论文投稿] 投稿求助，期刊 +4 希冀，有书读 2026-05-20 8/400 2026-05-22 10:16 by 希冀，有书读
[文学芳草园] 献血感触 +7 呀呀好傻 2026-05-19 13/650 2026-05-21 20:15 by 呀呀好傻
[基金申请] 面上本子正文33页，违规吗？会被低分嘛？ +14 1234567wang 2026-05-17 16/800 2026-05-21 17:58 by 脆脆的饼干
[基金申请] 国自然评分 +4 无名者登山 2026-05-20 5/250 2026-05-21 16:35 by swuq
[基金申请] 国自然上会要求 +7 无名者登山 2026-05-18 11/550 2026-05-21 15:50 by draco1987
[基金申请] 提交了我也来说说感想 +9 fummck 2026-05-20 10/500 2026-05-21 14:17 by draco1987
[基金申请] 评审有感 +15 popular289 2026-05-18 26/1300 2026-05-21 10:35 by 西葫芦炒鸡蛋
[有机交流] 反应很差，大量原料没有反应 5+3 Mr.Zot 2026-05-19 8/400 2026-05-20 22:19 by Equinoxhua
[考博] 如果工作了想读博，可以边工作边读全日制嘛？ 30+3 铁达火车 2026-05-18 5/250 2026-05-20 09:33 by tfang
[考博] 博士申请 +5 星…… 2026-05-18 6/300 2026-05-18 23:49 by 糊糊涂涂好
[硕博家园] 我在等一个没有答案的答案 +3 Love_MH 2026-05-17 3/150 2026-05-18 02:22 by 竹林孤影
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭