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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因
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badronger

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因 已有3人参与

利用Crispr技术敲除链霉菌种属的基因，但在第一步就花了两个月都没做出来，急！！！

我是直接用的别人构建好的质粒，这个质粒上原本就是20nt，我得要把这20nt置换下来，连接上我自己的20nt，我是用酶切的方式（此质粒文献中的方法），但是这个酶是BaeI酶，这个酶比较特殊而且酶切效率不是很高。目前遇到的最大问题是，我的负对照（酶切后的质粒做连接转化，没有我的20nt）和我的实i验组长出的板子单克隆很奇怪，是那种像针尖一样，硬的，透明的很小的单克隆，很难挑。但是也能摇出菌，可是经测序是原始质粒。
我目前最大困惑：
（1）就是为什么负对照和实验组（有我自己设计的20nt）长出的单克隆形态与原始质粒的单克隆（正常的大杆菌单克隆形态）非常不一致。
（2）虽说有可能是酶切效率不高，导致挑了很多单克隆都不是。但是我没切时间有8小时，我感觉足够长了，是不是BaeI这个酶太特别了

希望大神能帮忙一下，快三个了，没一点进展，老师逼得急啊
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1楼 2017-07-22 19:43:46
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-21 11:54:51
我怎么记得，Crispr的质粒，连上了别人的sgRNA之后，就不能替下来连自己的呢。。。必须要用空载切才行哎。。
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2楼2017-07-22 21:12:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by badronger at 2017-07-24 14:59:18
什么叫做空载切啊？卧室先酶切把别人的20bp切下来了，然后再连自己的20bp，这样不可以吗？
...

印象中不可以，因为别人连他的20bp的时候，就已经把酶切位点破坏掉了。你再切切不开。
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4楼2017-07-24 20:14:47
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有原始序列吗？可以在酶切设计的时候，考虑周全了，看看是否破坏酶切序列
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5楼2017-07-25 10:31:10
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普通回帖

badronger

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-07-22 21:12:13
我怎么记得，Crispr的质粒，连上了别人的sgRNA之后，就不能替下来连自己的呢。。。必须要用空载切才行哎。。

什么叫做空载切啊？卧室先酶切把别人的20bp切下来了，然后再连自己的20bp，这样不可以吗？

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3楼2017-07-24 14:59:18
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草溪河

铁虫 (著名写手)
请仔细分析这个酶的特点，识别序列

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6楼2017-07-28 18:33:34
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davidck

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-08-21 11:55:29
原因可能是模板没有去除干净；酶连接效率太低；导致最后的克隆都是阴性的。
你可以：
1. 最简单的做法，让公司去做。现在很多公司都接这种活儿。
2. 利用PCR的方法，将模板的20bp取代掉，然后dpnI酶将模板处理干净，这样可能效果会好些。但是也不排除还是存在假阳性。

另外，请教下关于链霉菌遗传操作的事情，最近打算做相关工作，但是从没做过。可以互相交流。
如有意，私信我你的联系方式。
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7楼2017-08-14 16:09:47
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易化星
8楼2017-08-17 16:19:20
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灵象雪
9楼2017-08-17 16:29:20
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易化星
10楼2017-08-17 22:04:06
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