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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 丝状真菌基因敲除 筛不出完全敲除的菌
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555weiteng

新虫 (初入文坛)

[求助] 丝状真菌基因敲除 筛不出完全敲除的菌 已有2人参与

丝状真菌用农杆菌介导的方法做基因敲除，上下游同源臂分别为3KB，在抗性板上出现的转化子做PCR验证，若敲除掉应该只有一条3KB的电泳条带，野生型只有一条1KB的带。现在挑了100个菌，出现的是只有1KB和两条带都有的情况。出现两条带的菌用另一对引物验证，显示部分基因组发生双交换，但不完全。请问一下做过真菌敲除实验的高手们，是菌没挑对，还需继续挑，还是需要对那些部分双交换的菌进行纯化，知道筛到纯的。

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1楼 2017-07-10 22:13:12
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1009238055

金虫 (小有名气)
这是没有同源重组，直接插入突变了吧，一百个都没有出来，再挑菌成功希望也不是很大，出现两条带的八成是插入突变了，建议重新转

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3楼2017-12-01 15:50:29
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awqqmxr817
2楼2017-08-19 20:39:34
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前行的璐

新虫 (小有名气)
你好，我想问下你是用的农杆菌什么菌种呢？我最近在做农杆菌的转化，希望可以向你请教
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4楼2017-12-02 11:35:13
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lggy1321

新虫 (著名写手)
用农杆重新转一次吧。继续挑也基本不会有3kb了吧

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5楼2017-12-23 22:50:14
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555weiteng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1009238055 at 2017-12-01 15:50:29
这是没有同源重组，直接插入突变了吧，一百个都没有出来，再挑菌成功希望也不是很大，出现两条带的八成是插入突变了，建议重新转

重新转了挑了500个还是没有，请问一般敲不掉多做几遍会敲掉吗？做了两遍都没敲掉，都怀疑是否能敲掉了。

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6楼2018-03-20 11:45:32
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555weiteng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 前行的璐 at 2017-12-02 11:35:13
你好，我想问下你是用的农杆菌什么菌种呢？我最近在做农杆菌的转化，希望可以向你请教

用的LBA4404

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7楼2018-03-20 11:45:56
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555weiteng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lggy1321 at 2017-12-23 22:50:14
用农杆重新转一次吧。继续挑也基本不会有3kb了吧

这是正常情况吗？还是因为我做转化时菌的状态没掌握好。

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8楼2018-03-20 11:47:59
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1009238055

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 555weiteng at 2018-03-20 11:45:32
重新转了挑了500个还是没有，请问一般敲不掉多做几遍会敲掉吗？做了两遍都没敲掉，都怀疑是否能敲掉了。
...

查查文献看看是不是敲除致死，敲除致死的话也挑不出转化子，并且筛选平板上菌落不会太多。如果致死，可以选择干扰。
如果敲除不致死，这样的情况就要考虑敲除材料和敲除体系有没有问题了，下次转的时候可以用一个验证正确带荧光的载体测一测敲除体系效率,再好好检查一下你的载体左右臂有没有问题，和基因组中其他编码区同源性怎么样。

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9楼2018-03-20 12:27:39
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555weiteng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 1009238055 at 2018-03-20 12:27:39
查查文献看看是不是敲除致死，敲除致死的话也挑不出转化子，并且筛选平板上菌落不会太多。如果致死，可以选择干扰。
如果敲除不致死，这样的情况就要考虑敲除材料和敲除体系有没有问题了，下次转的时候可以用一个验 ...

请教下怎么用带荧光的载体测敲除效率，十分想测测，现在还没有敲掉一个基因。
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10楼2018-03-27 16:43:19
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