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555weiteng

新虫 (初入文坛)

[求助] 丝状真菌基因敲除 筛不出完全敲除的菌 已有2人参与

丝状真菌用农杆菌介导的方法做基因敲除,上下游同源臂分别为3KB,在抗性板上出现的转化子做PCR验证,若敲除掉应该只有一条3KB的电泳条带,野生型只有一条1KB的带。现在挑了100个菌,出现的是只有1KB和两条带都有的情况。出现两条带的菌用另一对引物验证,显示部分基因组发生双交换,但不完全。请问一下做过真菌敲除实验的高手们,是菌没挑对,还需继续挑,还是需要对那些部分双交换的菌进行纯化,知道筛到纯的。

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1009238055

金虫 (小有名气)

这是没有同源重组,直接插入突变了吧,一百个都没有出来,再挑菌成功希望也不是很大,出现两条带的八成是插入突变了,建议重新转

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3楼2017-12-01 15:50:29
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前行的璐

新虫 (小有名气)

你好,我想问下你是用的农杆菌什么菌种呢?我最近在做农杆菌的转化,希望可以向你请教
4楼2017-12-02 11:35:13
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lggy1321

新虫 (著名写手)

用农杆重新转一次吧。继续挑也基本不会有3kb了吧

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5楼2017-12-23 22:50:14
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555weiteng

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 1009238055 at 2017-12-01 15:50:29
这是没有同源重组,直接插入突变了吧,一百个都没有出来,再挑菌成功希望也不是很大,出现两条带的八成是插入突变了,建议重新转

重新转了挑了500个还是没有,请问一般敲不掉多做几遍会敲掉吗?做了两遍都没敲掉,都怀疑是否能敲掉了。

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6楼2018-03-20 11:45:32
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