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qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

[求助] 求助:定量PCR结果无CT值

昨天跑了一次定量,想做标准曲线,但是出来的结果没有CT值。反应模板是线粒体DNA,引物、反应条件等都是经其他实验室测定、摸索过的。
我们把标准样品梯度稀释,只有浓度最高的样品有CT值,30多。
同时一起跑的几个待测样品,也有的有CT值(30多),有的没有。

这种情况是不是说明我们标准样品的浓度太低了?
下一步调整是需要增加样品浓度?还是增加循环次数时间?还是两个都要? 或者是因为别的问题?
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-05 07:42:28
一般荧光定量PCR Ct值30多,说明模板浓度比较低,需要提高模板浓度。PCR结束有扩增曲线的话再跑胶确认下片段大小。循环数可以增加到40。
保持平常心❤
3楼2017-07-04 09:03:08
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fano8o9sin

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是模板浓度太低了,一般循环次数设置到40
4楼2017-07-04 10:12:44
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-05 07:42:42
最好先用PCR试试条件,跑电泳确认能P出条带
坚持!
2楼2017-07-04 08:46:14
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许彦

木虫 (正式写手)

样本浓度吧,你有具体的实验扩增曲线图吗

发自小木虫IOS客户端
5楼2017-07-04 11:21:23
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贱贱JMe

木虫 (小有名气)

教导主任

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-05 07:43:01
没有设置内参吗,简单增加循环次数意义不大,CT过大并不能说明问题
想做一位科研好人
6楼2017-07-04 16:55:34
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普通回帖

qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-07-04 16:55:34
没有设置内参吗,简单增加循环次数意义不大,CT过大并不能说明问题

做标准曲线的,好像不用内参吧。。我们没设内参。等明天再换个标准样品,增加循环次数再试一下~
7楼2017-07-05 07:23:06
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qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stabilized at 2017-07-04 08:46:14
最好先用PCR试试条件,跑电泳确认能P出条带

我们打算换个标准样品,增加以下循环次数再试一下~等结果出来了,如果还没有CT值,就再麻烦大家帮忙分析一下~
8楼2017-07-05 07:29:42
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qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yucuiyuan00 at 2017-07-04 09:03:08
一般荧光定量PCR Ct值30多,说明模板浓度比较低,需要提高模板浓度。PCR结束有扩增曲线的话再跑胶确认下片段大小。循环数可以增加到40。

我们打算换个标准样品,增加以下循环次数再试一下~等结果出来了,如果还没有CT值,就再麻烦大家帮忙分析一下~

上次都忘了该跑一次胶看看。下次如果还不行,就跑一次胶~谢谢!
9楼2017-07-05 07:31:30
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qiaoqiao1223

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fano8o9sin at 2017-07-04 10:12:44
应该是模板浓度太低了,一般循环次数设置到40

我们打算换个标准样品,增加以下循环次数再试一下~等结果出来了,如果还没有CT值,就再麻烦大家帮忙分析一下~
10楼2017-07-05 07:32:12
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