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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大片段DNA酶切连接效率怎么提高
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zhenliu1991

新虫 (初入文坛)

[求助] 大片段DNA酶切连接效率怎么提高 已有2人参与

求助！！！构建文库时，单酶切的基因组DNA，用T4连接酶连接时，小片段DNA（<50Kb）连接效率很高，每2ul连接产物可达到5000个以上的单克隆，但是大片段DNA（~80Kb）连接效率很低，每2ul连接产物只有到600左右的单克隆，都进行了脱盐处理，也尝试了目的片段与载体的多种比例，都不能达到高效率，为什么？怎么提高大片段的连接效率？
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1楼 2017-06-16 17:54:43
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)
楼主的问题解决了么？我也准备做文库，看资料，没有像楼主这么溜的做大片段。。。很多文献就连载3-10kb大小的片段。也不太理解做大片段的目的是什么呢？
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2楼2017-06-22 14:32:41
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大雄-静宜

新虫 (初入文坛)
试试用噬菌体包装吧

发自小木虫IOS客户端
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3楼2017-06-22 21:52:29
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mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by yufeiwaner at 2017-06-22 14:32:41
楼主的问题解决了么？我也准备做文库，看资料，没有像楼主这么溜的做大片段。。。很多文献就连载3-10kb大小的片段。也不太理解做大片段的目的是什么呢？

真核生物的一个完整的基因都比较大，如果是研究基因簇的话，就更需要大片段。如果目标序列含有较长的重复序列时，也需要大片段。构建物理图谱时也需要大片段。
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书到用时方恨少
4楼2017-06-27 15:09:38
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mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以换载体试试，一般大片段的克隆都是比较难做的，条件允许的话，大片段的文库还是交给专业公司做会比较划算。
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书到用时方恨少
5楼2017-06-27 15:11:17
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yaodada123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主转化实验是用的电转还是化转？本人最近也在做文库构建，用T4酶连后大小在8kb。T4酶连后经过乙醇沉淀再电转，一直长不出菌落，很苦恼。将没有酶连的质粒电转入电感受态细胞，有菌落长出，说明电感受态细胞无问题。不知问题出在何处，恳请楼主赐教~谢谢~
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6楼2017-08-17 11:38:36
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