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zhenliu1991

新虫 (初入文坛)

[求助] 大片段DNA酶切连接效率怎么提高已有2人参与

求助!!!构建文库时,单酶切的基因组DNA,用T4连接酶连接时,小片段DNA(<50Kb)连接效率很高,每2ul连接产物可达到5000个以上的单克隆,但是大片段DNA(~80Kb)连接效率很低,每2ul连接产物只有到600左右的单克隆,都进行了脱盐处理,也尝试了目的片段与载体的多种比例,都不能达到高效率,为什么?怎么提高大片段的连接效率?
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yaodada123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主转化实验是用的电转还是化转?本人最近也在做文库构建,用T4酶连后大小在8kb。T4酶连后经过乙醇沉淀再电转,一直长不出菌落,很苦恼。将没有酶连的质粒电转入电感受态细胞,有菌落长出,说明电感受态细胞无问题。不知问题出在何处,恳请楼主赐教~谢谢~
6楼2017-08-17 11:38:36
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yufeiwaner

新虫 (小有名气)

楼主的问题解决了么?我也准备做文库,看资料,没有像楼主这么溜的做大片段。。。很多文献就连载3-10kb大小的片段。也不太理解做大片段的目的是什么呢?
2楼2017-06-22 14:32:41
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大雄-静宜

新虫 (初入文坛)

3楼2017-06-22 21:52:29
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mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by yufeiwaner at 2017-06-22 14:32:41
楼主的问题解决了么?我也准备做文库,看资料,没有像楼主这么溜的做大片段。。。很多文献就连载3-10kb大小的片段。也不太理解做大片段的目的是什么呢?

真核生物的一个完整的基因都比较大,如果是研究基因簇的话,就更需要大片段。如果目标序列含有较长的重复序列时,也需要大片段。构建物理图谱时也需要大片段。
书到用时方恨少
4楼2017-06-27 15:09:38
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