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RNA提取质量 已有5人参与
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使用方法：Trizol 目的：qPCR 样品：番茄叶片 问题描述：目前处于预实验阶段，前后提取了几次番茄叶片RNA，之前并未太过关注电泳图（因为并没有特别处理，就是一般的跑DNA的胶和缓冲液，私以为电泳可能也有降解效果可能会不好，但是如果严格处理，又太耗时耗力），只是着重测了浓度和OD比值，OD260：OD280一般在1.9到2.0左右，浓度却很奇怪，有时同时取得两个样品，一个六七百ng，一个却只有八九十一百多，很是纠结。后来尝试进行qPCR，主要还是想摸摸条件，结果非常不好，被老板骂，要我跑电泳确认RNA质量，结果前后提取的RNA跑了几次电泳，效果都不好，自己也没信心，不知道这RNA提成什么样才能进行下一步试验。有几个问题希望专家解疑： 1. 提取RNA浓度差异如此大是什么原因？ 2. 就目前提出的RNA的电泳图看质量，有什么问题，下一步怎么改进？ 3. 什么程度是满足qPCR的高质量RNA PS：染色是跑完胶扔到EB里染色，每次染色时间没有特意记，可能有染色不充分的，比如最后一张图。。。。  第一次提取  第二波，若干次提取，一起跑的电泳  第三次  第四次，第一泳道是第三次提的，2345是第四次提的，1234按照3ul+6ul水上样，5是4按照6ul上样  第五次@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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2楼2017-05-02 16:39:40
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6楼2017-05-03 08:25:47
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【答案】应助回帖
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可以说你多次提取的番茄叶片的RNA都有不同程度降解，第一次降解的特别严重，植物RNA中含有大量的多糖多酚，次生代谢物质以及大量的RNase，RNase活性很强，在整个试验过程中，无论内源RNase还是外源RNase即使微量都会使提取的RNA发生降解，酚类物质 在细胞破碎时被释放出来，被氧化后可以与核酸不可逆地结合导致RNA的活性丧失，降低RNA的质量。而多糖是影响RNA提取的另一个难题，多糖在水中的理化性质与RNA相似，在提取过程中往往会与RNA形成难溶的胶状物共同沉淀下来，常规提取方法难以将它们分开，而且在除去多糖的同时RNA也会被带走，造成RNA产量的降低。因此，在RNA提取过程中要抑制RNase活性、克服次生代谢物质的干扰，从而得到质量较好、纯度较高的RNA。 1、在提取的过程中最好使用提取植物RNA专用试剂，比如RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue，CTAB法，pvp法，总之关于植物提取的方法，网上一搜一大把。 2、提取的过程也要注意使用的裂解Buffer用量，用量太少，会导致RNA降解，用量过多，洗涤不充分，会导致高盐、酚类等残留，RNA纯度不好，抑制后续PCR的扩增。其实番茄叶片还是很好提取的材料。 3、提取优质的RNA标准，见下图 |
8楼2017-05-03 08:46:28
wenting9999
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9楼2017-05-03 08:52:56
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请问上样量是什么意思？您看我理解对吗？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的叶片按10.20.40…mg还是加1ml trizol来算，请问是这个意思吗 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-05-02 16:53:04
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4楼2017-05-02 16:57:01
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梯度的话不太现实…我是用研钵研磨再用小勺收集到ep管，担心液氮干了会解冻造成降解，这一步都是快了再快的收集，损失其实是蛮大的，所以每次样品都是过量研磨的怕损失太大，一般都是收集的差不多到ep管的0.1ml那就加trizol了… 发自小木虫Android客户端 |
5楼2017-05-02 17:10:11
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【答案】应助回帖
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首先要明确，RNA并没有想象中的那么容易降解，前提是规范操作，环境满足要求，试剂无污染。这几点应该都很容易做到。戴口罩换手套，少走动，干净整洁，手法娴熟。 从你的提取结果可以看出，后来的比之前的效果好很多，可以说越来越好了。 插一句，EB染色一般推荐15分钟，但是不是绝对的，先配置的可以时间短一点，用时间长的多染一会。要达到什么样的目的，并不是看检测的条带是不是都很亮，而是要看Marker，看Marker的条带有亮暗之分，这样才能比较容易或者说是准确的估算样品的量。不知道你是否理解。可以自己摸索一下，实验几次就知道多少时间比较合适。 然后，提取RNA并不是材料的量多就能提出来的RNA就多，第一步很重要，研磨要充分，裂解要到位，细胞必须能够尽量多的释放出来RNA才能之后收集到更多的RNA。 最后，植物叶片是比较容易提取RNA的，选那些嫩的，一般都能满足荧光的要求。做之前准确定量RNA之后会省很多事。 提取RNA也算是比较常规的操作手法，多练练手法好了自然就好了。加油。 |
10楼2017-05-03 15:08:41
