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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA提取质量
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ufolt16

新虫 (初入文坛)

[求助] RNA提取质量已有5人参与

使用方法：Trizol
目的：qPCR
样品：番茄叶片
问题描述：目前处于预实验阶段，前后提取了几次番茄叶片RNA，之前并未太过关注电泳图（因为并没有特别处理，就是一般的跑DNA的胶和缓冲液，私以为电泳可能也有降解效果可能会不好，但是如果严格处理，又太耗时耗力），只是着重测了浓度和OD比值，OD260：OD280一般在1.9到2.0左右，浓度却很奇怪，有时同时取得两个样品，一个六七百ng，一个却只有八九十一百多，很是纠结。后来尝试进行qPCR，主要还是想摸摸条件，结果非常不好，被老板骂，要我跑电泳确认RNA质量，结果前后提取的RNA跑了几次电泳，效果都不好，自己也没信心，不知道这RNA提成什么样才能进行下一步试验。有几个问题希望专家解疑：
1. 提取RNA浓度差异如此大是什么原因？
2. 就目前提出的RNA的电泳图看质量，有什么问题，下一步怎么改进？
3. 什么程度是满足qPCR的高质量RNA
PS：染色是跑完胶扔到EB里染色，每次染色时间没有特意记，可能有染色不充分的，比如最后一张图。。。。

RNA提取质量
第一次提取


RNA提取质量-1
第二波，若干次提取，一起跑的电泳


RNA提取质量-2
第三次


RNA提取质量-3
第四次，第一泳道是第三次提的，2345是第四次提的，1234按照3ul+6ul水上样，5是4按照6ul上样


RNA提取质量-4
第五次@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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1楼2017-05-02 15:58:24
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wenting9999

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufolt16(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-05-04 16:37:21
可以说你多次提取的番茄叶片的RNA都有不同程度降解，第一次降解的特别严重，植物RNA中含有大量的多糖多酚，次生代谢物质以及大量的RNase，RNase活性很强，在整个试验过程中，无论内源RNase还是外源RNase即使微量都会使提取的RNA发生降解，酚类物质
在细胞破碎时被释放出来，被氧化后可以与核酸不可逆地结合导致RNA的活性丧失，降低RNA的质量。而多糖是影响RNA提取的另一个难题，多糖在水中的理化性质与RNA相似，在提取过程中往往会与RNA形成难溶的胶状物共同沉淀下来，常规提取方法难以将它们分开，而且在除去多糖的同时RNA也会被带走，造成RNA产量的降低。因此，在RNA提取过程中要抑制RNase活性、克服次生代谢物质的干扰，从而得到质量较好、纯度较高的RNA。
1、在提取的过程中最好使用提取植物RNA专用试剂，比如RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue，CTAB法，pvp法，总之关于植物提取的方法，网上一搜一大把。
2、提取的过程也要注意使用的裂解Buffer用量，用量太少，会导致RNA降解，用量过多，洗涤不充分，会导致高盐、酚类等残留，RNA纯度不好，抑制后续PCR的扩增。其实番茄叶片还是很好提取的材料。
3、提取优质的RNA标准，见下图
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珍惜生命
8楼2017-05-03 08:46:28
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-02 19:27:40
有些植物它本身RNA含量会比较高，建议降低你的番茄叶片上样量，从10MG,20，40，60，80MG做个梯度。样品量如果太高，就会使RNA降解。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2017-05-02 16:39:40
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ufolt16

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-02 16:39:40
有些植物它本身RNA含量会比较高，建议降低你的番茄叶片上样量，从10MG,20，40，60，80MG做个梯度。样品量如果太高，就会使RNA降解。

请问上样量是什么意思？您看我理解对吗？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的叶片按10.20.40…mg还是加1ml trizol来算，请问是这个意思吗

发自小木虫Android客户端
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3楼2017-05-02 16:53:04
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ufolt16 at 2017-05-02 16:53:04
请问上样量是什么意思？您看我理解对吗？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的叶片按10.20.40…mg还是加1ml trizol来算，请问是这个意思吗
...

恩，是的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2017-05-02 16:57:01
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