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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr出现目的条带但序列不对是怎么回事
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ztt279

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr出现目的条带但序列不对是怎么回事

我克隆目的序列，出现了目的条带，胶回收后连接T载体，转化，蓝白斑筛选，出现了白斑和蓝斑，然后菌液pcr，跑电泳后也出现了目的条带大小的前段，送去测序，却发现与目的片段不一致，这是怎么回事？恳请大牛指教

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1楼 2017-04-02 10:49:21
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江边鸟

银虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-14 07:50:21
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列，正反引物区有了，测序没问题。你再送pcr产物测序，产物测序结果正确再连载体。

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ztt279
2楼2017-04-02 11:00:14
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ztt279

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列，正反引物区有了，测序没问题。你再送pcr产物测序，产物测序结果正确再连载体。

看了一下，确实上下游引物是一样的，那我应该从哪一步改进呀？PCR体系吗？还是哪一步？
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3楼2017-04-02 12:03:07
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ztt279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列，正反引物区有了，测序没问题。你再送pcr产物测序，产物测序结果正确再连载体。

又看了一下，发现只有一条条带均含有上下游引物，其他的条带有的不含有，有的只含有上游或下游引物，而且与目的条带重叠的部分特别乱，要不然在中间，要不然在下游处，这是什么情况呀？
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4楼2017-04-02 12:21:45
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ztt279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列，正反引物区有了，测序没问题。你再送pcr产物测序，产物测序结果正确再连载体。

你说PCR产物直接测序，但是那样PCR产物很容易降解的呀，我还没有试过
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5楼2017-04-02 12:52:47
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neuralcrest

金虫 (正式写手)
可能你pcr出来的条带就不是你的目的基因，提高退火温度，或降低反应中的镁离子，或者换引物

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有朋自网上来不亦乐乎
6楼2017-04-04 07:31:26
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100913

新虫 (小有名气)
是全不一样还是只有一些碱基不同？

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7楼2017-04-04 07:41:49
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ztt279

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 100913 at 2017-04-04 07:41:49
是全不一样还是只有一些碱基不同？

只有23%左右的重复率，不一样的多

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8楼2017-04-04 09:08:05
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SFC玮子

新虫 (初入文坛)
同求？感觉是引物有问题，有大神可以解答么
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9楼2017-04-13 17:43:02
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yesucao

木虫 (正式写手)
重新设计引物吧，如果连T载体的测序结果每条都不同，说明扩出来时是混合条带，就算是PCR产物测序也有可能测不出来。

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10楼2017-04-13 23:13:40
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