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ztt279

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr出现目的条带但序列不对是怎么回事

我克隆目的序列,出现了目的条带,胶回收后连接T载体,转化,蓝白斑筛选,出现了白斑和蓝斑,然后菌液pcr,跑电泳后也出现了目的条带大小的前段,送去测序,却发现与目的片段不一致,这是怎么回事?恳请大牛指教

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江边鸟

银虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-14 07:50:21
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列,正反引物区有了,测序没问题。你再送pcr产物测序,产物测序结果正确再连载体。

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2楼2017-04-02 11:00:14
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ztt279

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
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2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列,正反引物区有了,测序没问题。你再送pcr产物测序,产物测序结果正确再连载体。

看了一下,确实上下游引物是一样的,那我应该从哪一步改进呀?PCR体系吗?还是哪一步?
3楼2017-04-02 12:03:07
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ztt279

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列,正反引物区有了,测序没问题。你再送pcr产物测序,产物测序结果正确再连载体。

又看了一下,发现只有一条条带均含有上下游引物,其他的条带有的不含有,有的只含有上游或下游引物,而且与目的条带重叠的部分特别乱,要不然在中间,要不然在下游处,这是什么情况呀?
4楼2017-04-02 12:21:45
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ztt279

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 江边鸟 at 2017-04-02 11:00:14
连t载的测序结果看一下有没有测出你的正反引物序列,正反引物区有了,测序没问题。你再送pcr产物测序,产物测序结果正确再连载体。

你说PCR产物直接测序,但是那样PCR产物很容易降解的呀,我还没有试过
5楼2017-04-02 12:52:47
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neuralcrest

金虫 (正式写手)

可能你pcr出来的条带就不是你的目的基因,提高退火温度,或降低反应中的镁离子,或者换引物

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有朋自网上来不亦乐乎
6楼2017-04-04 07:31:26
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100913

新虫 (小有名气)

是全不一样还是只有一些碱基不同?

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7楼2017-04-04 07:41:49
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ztt279

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 100913 at 2017-04-04 07:41:49
是全不一样还是只有一些碱基不同?

只有23%左右的重复率,不一样的多

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8楼2017-04-04 09:08:05
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SFC玮子

新虫 (初入文坛)

同求?感觉是引物有问题,有大神可以解答么
9楼2017-04-13 17:43:02
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yesucao

木虫 (正式写手)

重新设计引物吧,如果连T载体的测序结果每条都不同,说明扩出来时是混合条带,就算是PCR产物测序也有可能测不出来。

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10楼2017-04-13 23:13:40
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