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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌培养菌量太少 已有2人参与

用的大肠杆菌是BL21,用LB培养基培养,在摇瓶发酵时到发酵结束OD600只有1,外源蛋白表达以包涵体形式存在,对菌体生长应该没有影响,观测ph变化是先下降到5左右,然后逐渐上升直8左右,感觉加入IPTG后就不长了,怎么办,求广大虫友帮忙。

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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

3楼2017-03-15 11:25:42
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渭城朝风

新虫 (初入文坛)

IPTG对菌体有毒性,你表达的蛋白可能也有毒性,且消耗大量氨基酸
希望大家互相学习互相交流
4楼2017-03-15 13:38:33
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liudongxijun

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你要做一个BL21培养的生长曲线,根据生长曲线在对数期加入IPTG(0.1-0.6 mM),如果有包涵体最好是在16-20℃低温诱导,加入IPTG后,菌种本身就是不以生长为主,以蛋白表达为主,LB培养大肠,本身OD就不会太高。不要听他们说在OD 1.5时诱导,一定要在对数期(OD 0.6-0.8)诱导,因为本身LB摇瓶就是这样一个定性实验,先把酶表达出来再说。
11楼2017-03-21 10:16:07
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普通回帖

小花木兰

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
IPTG 是否过量了,有毒性可能影响生长的
2楼2017-03-15 11:20:37
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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ganchao1776 at 2017-03-15 11:25:42
开始诱导OD是多少?

0.6多
5楼2017-03-16 19:56:16
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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 渭城朝风 at 2017-03-15 13:38:33
IPTG对菌体有毒性,你表达的蛋白可能也有毒性,且消耗大量氨基酸

IPTG不是不被菌体利用吗?表达的蛋白以包涵体形式存在,应该不会危害菌体的吧
6楼2017-03-16 19:57:36
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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小花木兰 at 2017-03-15 11:20:37
IPTG 是否过量了,有毒性可能影响生长的

之前做过IPTG诱导最佳表达量,选好了浓度,应该没有过量
7楼2017-03-16 19:58:38
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 氺泽兮木兰 at 2017-03-16 19:56:16
0.6多

诱导早了,你等到1.5左右再诱导试试

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8楼2017-03-16 21:30:01
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氺泽兮木兰

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ganchao1776 at 2017-03-16 21:30:01
诱导早了,你等到1.5左右再诱导试试
...

但是不诱导,只测生长曲线时,发酵20h,od也约为1

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9楼2017-03-16 22:39:29
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

噢,那可能是培养基有问题吧!

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10楼2017-03-17 07:46:59
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