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荧光原位杂交FISH镜检计数 已有3人参与
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小妹用荧光原位杂交法，测样品中被荧光标记细菌总数。 1、杂交完后，制作好的载玻片，在普通荧光显微镜下观察就可以还是要激光共聚焦显微镜，有什么区别？如果要看一般放大多少倍合适。 2、镜检的时候怎么计数呢？文献只查到数十几个随机视野，求平均值。怎么把这个结果换算成cell/ml菌液。 3、是否可以用流式细胞计算细菌总数，比载玻片镜检有什么优缺？ 发自小木虫IOS客户端 |
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Cells-Qi
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2楼2017-03-19 10:30:53
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有木有具体的方法呢？不过别说计数了，今天把做好的片子拿去看了，那边仪器的老师说找不到菌，看到的不知道是菌还是杂质，探针cy3标记的，然后dapi复染，暗视野紫外光只看到很少的几个蓝点，绿光下一片橙红色然后好多一粒一粒的颗粒连成片，不知道是不是菌。我甚至不知道应该是什么样的。第一次做感觉好绝望。也不知道方法对不对。 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2017-03-20 16:48:37
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-21 07:45:48
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连成片可能是浓度太大，稍微稀释一下再做片子！菌的话一般四十倍镜下就能看到啦！ 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-03-21 00:22:14
Cells-Qi
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5楼2017-03-21 00:26:48
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老师我按照这个方法做的，您看对吗？ 1、菌液+4%多聚甲醛固定，过夜 2、离心弃上清液，加0.01Mpbs混悬再离心弃掉上清液，重复一次，重悬0.01Mpbs:乙醇=1:1的溶液，-20度待用。 3、上液取20ul于载玻片，晾干，50%、80%、96%乙醇依次泡3min，晾干。 4、加荧光标记引物5ul和杂交缓冲液（自己配的，含甲酰胺、tris-hcl，nacl，sds），46度恒温箱杂交过夜。 5、杂交完后用清洗液清洗（tris-hcl，nacl，sds，edta，dapi） 6、在冰水里清洗几秒 封片镜检。 是不是清洗不够。老师您如果有时间方便线下加个好友指导下吗？ 发自小木虫IOS客户端 |
6楼2017-03-21 01:15:16
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载玻片由于直接买的多聚赖氨酸包被的，就没浸泡直接用了。还有加菌液晾干后，三种浓度乙醇脱水时总觉得菌液会被冲洗掉，用的染色缸，侧面竖着泡进去的。杂交缓冲液50ul和探针5ul好像量太多，加盖玻片后就溢出来了，不知道有木有影响。 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2017-03-21 01:20:00
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