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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒双酶切切不出片段
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cherry_cao

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切切不出片段 已有2人参与

在构建一个重组质粒，载体再加上一个启动子（259bp），酶切用的是TAKARA 的Q.Cut  Hind Ⅲ、PstⅠ，载体上有gfp基因片段，所以转化子可以表现荧光检测。
我挑取了发荧光的转化子，提质粒，酶切，但是没有切出来是怎么回事？
调过曝光还是看不见。
电泳图左→右，Marker 1kb Plus、plasmid、酶切1、酶切2、Marker DL 2000
重组质粒双酶切切不出片段
酶切.png
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1楼 2017-03-10 21:04:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-12 08:52:27
你这是marker加多了还是曝光度没有调好额，条带都看不清楚，你这个载体空载的时候，gfp前面有启动子么？还是是专门检测启动子的载体？可以重新做个酶切降低些质粒量，或者再选择其他的酶试试。另外可以用启动子的特异性引物或者通用引物，用质粒做模板做个PCR验证看看。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2017-03-11 22:29:27
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小冀-

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【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-13 07:44:50
引用回帖:
5楼: Originally posted by cherry_cao at 2017-03-11 23:20:35
连的不对是指什么？
嗯，我也猜会不会是突变了，但我还做过单酶切，两种酶都没切出来，如果突变，会发生两个酶切位点都变异吗？
...

那可能连的东西和你想要的根本就不是一回事，你可以测个序看看，估计不对

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···
6楼2017-03-11 23:22:14
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普通回帖

小冀-

版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连的不对或者目的基因上有突变

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2楼2017-03-11 12:25:06
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cherry_cao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2017-03-11 22:29:27
你这是marker加多了还是曝光度没有调好额，条带都看不清楚，你这个载体空载的时候，gfp前面有启动子么？还是是专门检测启动子的载体？可以重新做个酶切降低些质粒量，或者再选择其他的酶试试。另外可以用启动子的特 ...

是曝光度大，为了找小片段；
空载体做了阳性对照并不会产生GFP，所以应该是没有自身携带启动子；
很尴尬的是启动子前面只有一个酶切位点Hind3，所以要换两种酶这个想法做不了；
PCR的结果是有目的条带的T^T
我现在只能想是酶切位点变异，先去测序看看了

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4楼2017-03-11 23:18:49
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cherry_cao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-11 12:25:06
连的不对或者目的基因上有突变

连的不对是指什么？
嗯，我也猜会不会是突变了，但我还做过单酶切，两种酶都没切出来，如果突变，会发生两个酶切位点都变异吗？

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5楼2017-03-11 23:20:35
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cherry_cao

新虫 (初入文坛)
嗯嗯，是这么打算的，主要是相同条件构了两种不同启动子的质粒，一个正常一个不知道成什么样了，让我很无奈啊

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7楼2017-03-11 23:27:30
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cherry_cao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-11 23:22:14
那可能连的东西和你想要的根本就不是一回事，你可以测个序看看，估计不对
...

嗯嗯，是这么打算的，主要是相同条件构了两种不同启动子的质粒，一个正常一个不知道成什么样了，让我很无奈啊

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8楼2017-03-11 23:27:57
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小冀-

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引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-11 23:22:14
那可能连的东西和你想要的根本就不是一回事，你可以测个序看看，估计不对
...

好吧，好运

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9楼2017-03-11 23:29:38
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
换个内切酶重切

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付出定有回报
10楼2017-03-13 00:53:26
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