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yudaoqian88至尊木虫 (知名作家)
不良人
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[求助]
氨苄抗性的PUC18-3HA转化农杆菌GV3101问题 已有2人参与
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又来求助了 如题，要证明转录因子对启动子的调控，采用pGREEN2-0800-LUC/REN双荧光系统，转录因子是构建到了PUC18-3HA载体上，是amp抗性的。按照操作要转入农杆菌GV3101，第一次抗性弄错了，没长，第二次用amp，整个板子都是，和抗生素失效的感觉一样，也查询了一下，似乎确实有人遇到这样的问题。 接下来要转的话，是要提高抗生素浓度呢，还是更换农杆菌菌株？请过来人指点一二，谢谢。下面是粘贴其他人的资源： 标题: 请问有人将氨苄抗性的表达载体转入农杆菌吗？用的是哪种农杆菌呀？ 摘要: [请问有人将氨苄抗性的表达载体转入农杆菌吗？用的是哪种农杆菌呀？] 我把氨苄抗性的表达载体转入农杆菌EHA105、GV3103中，结果12小时就都长了满满一板子，然后又试了下LBA4404，结果又不长。哪位大侠做过的话指导下我吧，我的烟草眼看就不能注射了！ 关键词:[抗性 农杆菌 表达载体 载体 菌株 实验室 质粒]…… 关键词: 抗性 农杆菌 表达载体 载体 菌株 实验室 质粒 我把氨苄抗性的表达载体转入农杆菌EHA105、GV3103中，结果12小时就都长了满满一板子，然后又试了下LBA4404，结果又不长。哪位大侠做过的话指导下我吧，我的烟草眼看就不能注射了！ 回复 试试GV3101、EHA103看吧。不是很清楚。 回复 看质粒有没有整合区。没有的话要用90RK菌株用三抗筛选。氨苄 最好换成羧卞，加利福平 庆大霉素，我记得这个菌株有两个也不三个抗性。有点记不清了 这个菌株很难做，楼主再查查 。 回复 我们实验室也转化过氨苄抗性的，确实板会长的没法用，后来我们都改用卡纳抗性的载体了 回复 我们实验室也转化过氨苄抗性的，确实板会长的没法用，后来我们都改用卡纳抗性的载体了 不要这样啊，这不是要重做的节奏嘛，我好不容易做好的载体  回复 A4用了吗 没太看懂什么意思 回复 我们DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 回复 用EHA105 将氨苄浓度提高四倍可以筛选出来。 回复 用EHA105 将氨苄浓度提高四倍可以筛选出来。 我正在做这种尝试，希望有用呀 回复 我们DH5a用的AMP,GV3101用的KANA,RIF,CARB,Mgcl2. 谢谢你，我借个GV3101试试。 回复 谢谢你，我借个GV3101试试。... |
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-02-15 07:53:51
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2017-02-15 07:53:51
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我不常上小木虫，但是，每当我看到有人问类似的问题，我就有点担忧。 按理说，导师应该是学生的指导人，是有一定学术水平、有过科班训练、发表过有一定水准的SCI论文、并且能够提供有益的指导、避免缺少或者无经验的学生或下属走弯路的带头人。可惜，国内外，有很多导师并不称职，并不配作为硕士或博士导师，科研已经成为个人捞取名利的手段，全无应有的风度与做派。导致师生反目、学生厌学或抑郁的事情，常有发生。所以，学生选导师，不要看称号、不要看学校，而要看导师本身的水准与实验室条件以及人品。即使你是哈佛毕业的，没有独立一作的拿得出手的论文，你照样没法在科研领域里生存。 早些年，只要你是所谓的名校毕业的，没有本事的混混也能拿到好待遇，现在是：不以出身论英雄，也算是一点进步，给底层一点鼓励吧。 我想说的是，从你的载体名可以看出，我猜失败的主要的原因是：你用的是原生质表达用的pUC载体，并不含有T-DNA区等农杆菌载体的特点，故不能在农杆菌里使用。正确的是更换effector质粒为pCAMBIA系列的质粒或者pBI121系列的质粒。我实验室的学生几年过犯过一个类似的错误，被我及时发现阻止了。 |
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8楼2017-02-14 22:43:21
Lau_Kimura
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-14 07:45:54
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-14 07:45:54
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管它长多长少，有没有挑菌做菌落PCR验证，看有没有转进去。你验证过是不是假阳性了吗？ 要验证抗生素是否失效，可以直接用感受态涂板，作为阴性对照的。 新手做实验哪能不设计对照组的呢？你老板知道看打不打死你。 |
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2楼2017-02-14 03:32:12
yudaoqian88: 回帖置顶 2017-02-14 09:54:14
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amp容易变坏，要新鲜配置，不能太多水汽。有一个amp替代物，carbenicilin 以后可以尝试 发自小木虫IOS客户端 |
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4楼2017-02-14 07:44:48
yudaoqian88
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送红花一朵 |
非常感谢这位老师的帮助。 我硕士博士都在同一个研究所读的，所以对其他实验室了解的不多。前段时间由于实验需要，有幸去中科院植物所一个老师那里学习实验，看到人家的培养模式确实不一样，基本上是小组性质的，一个导师手下有一到两名助理，往下就是学生，导师基本同学生一样来往于实验室，能够给予具体的实验指导。当然，这些大牛的实验室有丰富的科研积淀，有成熟的实验体系，实验路线和技术是我们这些底层实验室所不能比拟的。 我们的情况类似于金字塔，塔尖是老板，是导师，依靠位置优势搞合作拿项目。往下面是小老师，负责课题基本科研事物，基金申请，结题等等等等。学生也是这部分人负责的。但老师们真的是忙呀，导师就更不用说了。在学术水平上，导师更多的是指导方向，具体的实验导师们自己都摇头的，这点无可厚非。小老师们会给学生一些指导，但课题的杂活是在太多，每来一个新人都忙到手足无措。所以具体实验上的指导就别提了，都是学生自己摸索吧。因为老师们不用下实验室，所以脱节了。 我们虽然在学术上没啥成果，但导师本人对我们要求还是挺严格的，开题以及平时汇报都会尽可能邀请专家来指导，这点我们很感激。也听过很多科研院所，相比之下，我们这里对学生的指导帮助，对学生态度等方面算是不错的，有的地方更惨。 再次感谢老师的帮助 |
10楼2017-02-14 23:38:35
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正在学习这方面的:请问是不是还要设计个不含有AMP的培养基作为对照啊，还是需要设计个同时含有X-Gal啊？ 发自小木虫Android客户端 |
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3楼2017-02-14 05:03:39
yudaoqian88
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yudaoqian88
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