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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » LB平板培养大肠杆菌，不长菌，或零星几个
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upwardkl

新虫 (初入文坛)

[求助] LB平板培养大肠杆菌，不长菌，或零星几个 已有5人参与

近一个多月以来，自制的感受态细胞（Top10和DH5&）,测OD600值，均为0.5左右，

后将T-A克隆的产物做转化，使用的平板为LB固体平板，平板涂布，37度培养，至少要等14-16h后，才能看到零星的菌，且特小，有时候甚至没有菌，，

寻求原因和实验指导和帮助！
谢谢！
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雪霁花开，向上追求
1楼 2017-01-10 14:52:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

月夜听雨0323

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2017-03-05 08:54:53
可以试着测以下感受态的效价，或者直接买个感受态，我用的是诺维赞家的，价格便宜，用的也不错
感受态测效价方法是：转1ng高质量的质粒到100μl感受态中 ——> 按克隆转化流程：冰上静置、热激、冰冷、补培养基、摇菌
    ——> 取1/10涂板，培养过夜 ——> 长1000个单菌落，效价为10^7
    举例子：
    假设取0.1ng pUC19质粒转入100μl待测的感受态细菌中，按常规转化步骤进行冰浴和热击，加入900μlSOC培养基继续培养（此时DNA浓度为0.1ng DNA/ml，这里也可使用LB培养基，但最后得到的克隆菌的数目可能会降低）。然后再用SOC培养基进行1:10稀释（此时DNA浓度变为0.01ng DNA/ml），分别取100μl（含总量为0.001ng的DNA）涂布至两个平行的平板中。如果最后产生的菌落数为200 个（两个平板菌落的平均数），则转化效率为：
200 cfu/0.001ng = 2×10^8 cfu/μg
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7楼2017-01-11 10:34:27
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wskisaac

金虫 (著名写手)
建议先从公司买商业感受态，以此为基础做自己感受态。OD最好0.3-0.4最好。先阳转质粒试试，别先做克隆。

发自小木虫IOS客户端
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

upwardkl
9楼2017-01-11 15:52:07
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hch123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-11 07:42:58
你是不是菌种不对啊，建议你更换靠谱点的菌种（一定要靠谱）再做一批感受态试试。同时建议你转个PUC19看看长斑情况，如果还这样呢估计就是菌种不对了。
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脚踏实地：遇一个，学一个，会一个。。。
2楼2017-01-10 16:09:36
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amyz327

新虫 (小有名气)
这很正常啊，我一般放16个小时。可能感受态活性不好

发自小木虫IOS客户端
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4楼2017-01-10 21:29:16
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010308Jing

木虫 (正式写手)
感受态的效果不好，抗性加多了？

发自小木虫Android客户端
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5楼2017-01-10 21:43:13
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wkj5257

新虫 (小有名气)
我做感受态OD值在0.3-0.4，效果超级好，

发自小木虫Android客户端
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分子生物学，未来科技的领导者
6楼2017-01-11 00:00:24
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zlimba

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
选择哪种菌一般不会有太大问题，应该考虑一下实验药品和自己的操作，做阴性阳性对照。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

upwardkl
8楼2017-01-11 15:25:10
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wskisaac

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
11楼: Originally posted by upwardkl at 2017-01-11 16:42:47
谢谢你的应助，请问如何使用买来的感受态，以此为基础做自己的感受态呢？...

就用一般的氯化钙方法做就好，网上很多，一查就知道。关键是菌不要长过了，和氯化钙要纯。

发自小木虫IOS客户端
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

upwardkl
12楼2017-01-12 07:51:52
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hch123

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-05 08:55:57
引用回帖:
3楼: Originally posted by upwardkl at 2017-01-10 20:37:23
谢谢你的应助，我们重复做过感受态了，长菌的情况也差不多，，，

可是你的菌种靠谱吗，就像楼上说的，建议你买个天根Top10,用他的东西划线做菌种。一般DH5斑小一点还可以接受，TOP10斑也小，那就太难受了。
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脚踏实地：遇一个，学一个，会一个。。。
13楼2017-01-12 09:55:08
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猫咪先生

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同学，我之前也是，但是我发现我的  培养基拿错了。TA克隆的话，载体是19-T，要用  A板  培养。
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方法总比困难多！
14楼2017-01-12 10:30:52
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普通回帖

upwardkl

新虫 (初入文坛)
谢谢你的应助，我们重复做过感受态了，长菌的情况也差不多，，，
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雪霁花开，向上追求
3楼2017-01-10 20:37:23
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upwardkl

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by zlimba at 2017-01-11 15:25:10
选择哪种菌一般不会有太大问题，应该考虑一下实验药品和自己的操作，做阴性阳性对照。

请问怎么做阳性与阴性对照？
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雪霁花开，向上追求
10楼2017-01-11 16:40:05
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