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Rdan

新虫 (小有名气)

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[求助] 酶切验证已有4人参与

各位前辈，做酶切验证2月有余，一直切不开苦于不知道什么原因，特来求助。如图是，最新一次华大合成嗯引物，泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。目的基因大小应为3301，T载体是2692。加起来质粒应为6000左右。三次合成带酶切位点的引物pcr都能扩增出条带，但是提取的质粒大小也对，唯独切不开。请各位前辈帮忙分析一下是否是酶切位点的设计有问题，还是合成过程突变或者甲基化了。另外，酶切体系是：10*buffer 2ul, apaI1ul,kpnI1ul ,质粒5 ul,ddh2
o 11ul.37°，2h

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1楼 2016-12-24 21:15:15

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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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同意7楼观点，明显ApaI是切出两条带。你现在具体的实验，是不是先扩增，然后使用TA克隆导入载体，然后双酶切，你这种情况要排出序列和载体中均没有ApaI位点，不知道你是怎么做的？再者，你这个图要跑一个没有酶切的质粒作为对照，这样更有利于判断你单酶切的效果。最后还有一点你需要注意，每个酶的工作buffer是不同的，需要查一下说明书，看一下是否在你选用的buffer中两个酶的活性都很好，比如说NEB的酶，cutsmart buffer适合很多种酶，但也有没有活性的。所以方方面面都要考虑到。最后给个建议，转入T载体再酶切其实没必要，在引物上直接加上保护碱基，直接双酶切，直接往表达载体上连吧，省去TA克隆，还能省点时间。

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