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酶切验证 已有4人参与
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各位前辈，做酶切验证2月有余，一直切不开苦于不知道什么原因，特来求助。如图是，最新一次华大合成嗯引物，泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。目的基因大小应为3301，T载体是2692。加起来质粒应为6000左右。三次合成带酶切位点的引物pcr都能扩增出条带，但是提取的质粒大小也对，唯独切不开。请各位前辈帮忙分析一下是否是酶切位点的设计有问题，还是合成过程突变或者甲基化了。另外，酶切体系是：10*buffer 2ul, apaI1ul,kpnI1ul ,质粒5 ul,ddh2 o 11ul.37°，2h 发自小木虫Android客户端 |
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sky蒲公英
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质粒做pcr了吗？如果质粒pcr扩出来，酶切时间可以相应的增长些，过夜切。或者再找酶切位点，换一个酶进行单酶切。以前碰到过这种情况，刚开始没有切开，后来过夜切就切开了，测序也对。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-12-25 13:18:19
mlxmiao
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3楼2016-12-25 10:18:55
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7楼2016-12-25 16:06:15
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8楼2016-12-25 16:14:53
yujiaping1
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同意7楼观点，明显ApaI是切出两条带。你现在具体的实验，是不是先扩增，然后使用TA克隆导入载体，然后双酶切，你这种情况要排出序列和载体中均没有ApaI位点，不知道你是怎么做的？再者，你这个图要跑一个没有酶切的质粒作为对照，这样更有利于判断你单酶切的效果。最后还有一点你需要注意，每个酶的工作buffer是不同的，需要查一下说明书，看一下是否在你选用的buffer中两个酶的活性都很好，比如说NEB的酶，cutsmart buffer适合很多种酶，但也有没有活性的。所以方方面面都要考虑到。最后给个建议，转入T载体再酶切其实没必要，在引物上直接加上保护碱基，直接双酶切，直接往表达载体上连吧，省去TA克隆，还能省点时间。 发自小木虫IOS客户端 |
11楼2016-12-25 21:27:14
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13楼2016-12-26 02:49:26
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按照你说的，6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。那么两个单酶切条带都不一样大，第一个考虑酶切位点不止一个(楼上已经提到过了)，第二一个就是pcr扩增的时候有突变，第三个就是你最好加一个质粒的对照，到底切没切开一看就知道了 发自小木虫Android客户端 |
18楼2016-12-26 14:30:30
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2楼2016-12-25 09:35:05
4楼2016-12-25 13:12:41
质粒pcr是对的。曾经前两次合成的引物也是切不开，后来送出去测序发现合成错了。所以这次换了个公司合成，还是这种情况。所以，觉得可能不是合成的问题，所以来请教前辈们。我之前试着切过5个小时，也没有切开。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-12-25 14:45:12
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