| 查看: 4540 | 回复: 19 | ||
[求助]
酶切验证 已有4人参与
|
||
|
各位前辈，做酶切验证2月有余，一直切不开苦于不知道什么原因，特来求助。如图是，最新一次华大合成嗯引物，泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。目的基因大小应为3301，T载体是2692。加起来质粒应为6000左右。三次合成带酶切位点的引物pcr都能扩增出条带，但是提取的质粒大小也对，唯独切不开。请各位前辈帮忙分析一下是否是酶切位点的设计有问题，还是合成过程突变或者甲基化了。另外，酶切体系是：10*buffer 2ul, apaI1ul,kpnI1ul ,质粒5 ul,ddh2 o 11ul.37°，2h 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有124人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
sky蒲公英
版主 (文坛精英)
- 应助: 177 (高中生)
- 贵宾: 15.664
- 金币: 119295
- 散金: 13465
- 红花: 300
- 沙发: 1428
- 帖子: 19480
- 在线: 5618.4小时
- 虫号: 3384889
- 注册: 2014-08-27
- 性别: GG
- 专业: 免疫生物学
- 管辖: 文献求助
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-26 07:42:37
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-26 07:42:37
|
质粒做pcr了吗？如果质粒pcr扩出来，酶切时间可以相应的增长些，过夜切。或者再找酶切位点，换一个酶进行单酶切。以前碰到过这种情况，刚开始没有切开，后来过夜切就切开了，测序也对。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-12-25 13:18:19
mlxmiao
木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 金币: 7174.3
- 散金: 4871
- 红花: 15
- 帖子: 2883
- 在线: 311.8小时
- 虫号: 127413
- 注册: 2005-12-08
- 专业: 园艺学与植物营养学
3楼2016-12-25 10:18:55
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-12-26 07:42:54
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-12-26 07:42:54
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2016-12-25 16:06:15
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2016-12-25 16:14:53
yujiaping1
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1365.2
- 散金: 10
- 红花: 5
- 帖子: 1174
- 在线: 66.6小时
- 虫号: 929883
- 注册: 2009-12-17
- 性别: MM
- 专业: 疫苗学
|
同意7楼观点，明显ApaI是切出两条带。你现在具体的实验，是不是先扩增，然后使用TA克隆导入载体，然后双酶切，你这种情况要排出序列和载体中均没有ApaI位点，不知道你是怎么做的？再者，你这个图要跑一个没有酶切的质粒作为对照，这样更有利于判断你单酶切的效果。最后还有一点你需要注意，每个酶的工作buffer是不同的，需要查一下说明书，看一下是否在你选用的buffer中两个酶的活性都很好，比如说NEB的酶，cutsmart buffer适合很多种酶，但也有没有活性的。所以方方面面都要考虑到。最后给个建议，转入T载体再酶切其实没必要，在引物上直接加上保护碱基，直接双酶切，直接往表达载体上连吧，省去TA克隆，还能省点时间。 发自小木虫IOS客户端 |
11楼2016-12-25 21:27:14
|
本帖内容被屏蔽 |
13楼2016-12-26 02:49:26
781055707
木虫 (著名写手)
- 应助: 291 (大学生)
- 金币: 3118.2
- 散金: 46
- 红花: 19
- 帖子: 2030
- 在线: 579.3小时
- 虫号: 3046113
- 注册: 2014-03-13
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
14楼2016-12-26 09:58:58
小冀-
版主 (著名写手)
- 应助: 713 (博后)
- 贵宾: 3.033
- 金币: 11446.9
- 散金: 1055
- 红花: 82
- 帖子: 2509
- 在线: 445.9小时
- 虫号: 1521695
- 注册: 2011-12-03
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
按照你说的，6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。那么两个单酶切条带都不一样大，第一个考虑酶切位点不止一个(楼上已经提到过了)，第二一个就是pcr扩增的时候有突变，第三个就是你最好加一个质粒的对照，到底切没切开一看就知道了 发自小木虫Android客户端 |
18楼2016-12-26 14:30:30
sky蒲公英
版主 (文坛精英)
- 应助: 177 (高中生)
- 贵宾: 15.664
- 金币: 119295
- 散金: 13465
- 红花: 300
- 沙发: 1428
- 帖子: 19480
- 在线: 5618.4小时
- 虫号: 3384889
- 注册: 2014-08-27
- 性别: GG
- 专业: 免疫生物学
- 管辖: 文献求助
2楼2016-12-25 09:35:05
4楼2016-12-25 13:12:41
质粒pcr是对的。曾经前两次合成的引物也是切不开，后来送出去测序发现合成错了。所以这次换了个公司合成，还是这种情况。所以，觉得可能不是合成的问题，所以来请教前辈们。我之前试着切过5个小时，也没有切开。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-12-25 14:45:12
9楼2016-12-25 18:05:51
10楼2016-12-25 18:07:07