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细胞转染筛选问题 已有4人参与
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我用一个质粒转染了细胞，质粒上的功能集团（包含rfp）可以整合细胞系基因组，转染之后能看到红色荧光，那么有什么办法能将有红色荧光的细胞筛选出来呢，有红色荧光的是不是有可能也是瞬时表达，那么怎样将转基因的细胞筛选出来呢？求大神支招，谢谢！  |
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7楼2016-12-13 09:17:49
8楼2016-12-23 13:45:06
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我这边看到一个筛选稳转株的文章，复制粘贴下，楼主看看能不能用，主要是具体的实验操作： 48h加入选择性抗生素进行稳转株筛选，预实验确定抗生素的杀伤浓度（在规定时间内，将细胞全部杀死的最低浓度）。 1. 提前一天接种细胞与24孔板中，待第二天长成25%单层为宜，二氧化碳培养箱中37℃过夜培养； 2.第二天将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增； 3.培养7-10天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准，筛选细胞时刻适当提高浓度； 4.二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代，使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆，有限稀释法挑取单克隆。 5.Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况，挑取多个单克隆进行表达检测，筛选出表达量最高的克隆传代并保存。最终进行稳转株筛选高表达的稳定细胞株，相对于瞬时转染稳定细胞系构建需大量的时间和成本，是满足活性蛋白大量制备的最好方法。 这个应该是个通用的实验步骤，楼主结合自己的情况看看能不能用吧。 |
9楼2018-04-19 10:53:35
10楼2018-04-19 11:01:16
