24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 1190  |  回复: 7

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化 已有3人参与

道友们,请教一个问题,做质粒的重组实验,先将目的片段连入T载体,之后挑选序列正确的菌,提取质粒后,双酶切,得到三条长带(1200,2200,2800)(因为T载体上有相同的酶切位点),其中2200是目的片段,1200和2800为T载体上的。电泳切胶后,切得2200bp片段胶回收,然后连接入表达载体中,转化后,挑选阳性菌跑PCR。结果绝大多数条带是1200,还有2800的,测序是T载体上的,而我的目的条带却很少有?求教为什么啊,重复过多次了!!!

发自小木虫Android客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

是做连接的问题吗,连接时20ul体系,质粒回收产物浓度50ng/ul,加入1ul,目的片段回收产物与质粒浓度比3~5:1左右

发自小木虫Android客户端
2楼2016-11-14 20:18:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lingxfqibebt

木虫 (小有名气)

片段越小越容易连接上,切胶不干净,几个,片段相近不容易分离

发自小木虫Android客户端
3楼2016-11-14 22:18:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:29
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:30
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净
4楼2016-11-15 10:30:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:08:12
是连接的问题吧,要不然就是回收的时候出现了问题

发自小木虫Android客户端
···
5楼2016-11-15 11:46:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-11-15 10:30:21
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净

跑过电泳,有2200和2800的条带,并且2200的条带亮一些,并没有1000多的带。

发自小木虫Android客户端
6楼2016-11-15 16:52:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这个问题比较复杂了,先想办法将2800bp的片段破坏,凝胶电泳2200和2800一般是不太好区分的,建议将2800bp的片段破坏,同时电泳的时候多跑一些时间在切胶。

或者采用第二个办法就是切pcr产物
7楼2016-11-16 10:39:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cry_2013

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Yuanfang_818 at 2016-11-15 16:52:48
跑过电泳,有2200和2800的条带,并且2200的条带亮一些,并没有1000多的带。
...

你测序结果是T载体上1200bp那一部分吗?凝胶成像仪照相的时候有没有把光圈调大或者曝光看看,确定一下1200那个位置是不是确实没条带,我还是觉得胶回收那的问题,因为我最近也遇到类似情况,我是想办法把杂带去除了,然后菌液PCR就有结果了,不过还没有测序,还不知道是不是阳性克隆。。。。
8楼2016-11-16 14:03:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Yuanfang_818 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 330分求调剂 +13 qzenlc 2026-03-29 13/650 2026-04-02 16:45 by SZW_UJN
[考研] 材料求调剂一志愿哈工大324 +10 闫旭东 2026-03-28 12/600 2026-04-02 14:37 by olim
[考研] 342求调剂 +13 Mary Keen 2026-03-28 14/700 2026-04-02 14:28 by olim
[考研] 275求调剂 +13 jjjjjjjjjjl 2026-03-27 13/650 2026-04-02 13:07 by yulian1987
[考研] 270求调剂 +8 小杰pp 2026-03-31 10/500 2026-04-02 12:57 by yulian1987
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +8 cs0106 2026-04-01 9/450 2026-04-02 10:36 by 不吃魚的貓
[考研] 材料科学与工程调剂 +18 深V宿舍吧 2026-03-30 19/950 2026-04-02 10:28 by sanrepian
[考研] 311求调剂 +16 zchqwer 2026-04-01 18/900 2026-04-02 10:15 by 不吃魚的貓
[考研] 070305高分子化学与物理 304分求调剂 +14 c297914 2026-03-28 14/700 2026-04-02 09:35 by 星空星月
[考博] 26年申博 +3 staryer 2026-03-30 4/200 2026-04-01 23:21 by ai4pharm
[考研] 295材料工程专硕求调剂 +19 1428151015 2026-03-27 19/950 2026-04-01 22:34 by peike
[考研] 284求调剂 +12 小熊~~ 2026-03-31 12/600 2026-04-01 20:23 by 花??
[考研] 332求调剂 +8 Lyy930824@ 2026-03-29 8/400 2026-04-01 18:40 by 千钧澄玉宇啊
[考研] 0710生物学考研调剂 +3 李多米lee. 2026-03-27 4/200 2026-04-01 16:21 by zzchen2000
[考研] 材料与化工调剂一志愿大连海事085600,349 +9 吃的不少 2026-03-30 9/450 2026-04-01 11:24 by wangjy2002
[考研] 土木304求调剂 +5 顶级擦擦 2026-03-31 5/250 2026-04-01 08:15 by fdcxdystjk¥
[考研] 352分-085602-一志愿985 +6 海纳百川Ly 2026-03-29 6/300 2026-03-31 21:06 by yuq
[考研] 334求调剂 +7 Trying] 2026-03-31 7/350 2026-03-31 12:33 by 无际的草原
[考研] 085602化工求调剂(331分) +8 111@127 2026-03-30 8/400 2026-03-30 21:23 by 研究僧导导
[考研] 348求调剂 +6 小懒虫不懒了 2026-03-28 6/300 2026-03-30 10:29 by Evan_Liu
信息提示
请填处理意见