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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化 已有3人参与

道友们,请教一个问题,做质粒的重组实验,先将目的片段连入T载体,之后挑选序列正确的菌,提取质粒后,双酶切,得到三条长带(1200,2200,2800)(因为T载体上有相同的酶切位点),其中2200是目的片段,1200和2800为T载体上的。电泳切胶后,切得2200bp片段胶回收,然后连接入表达载体中,转化后,挑选阳性菌跑PCR。结果绝大多数条带是1200,还有2800的,测序是T载体上的,而我的目的条带却很少有?求教为什么啊,重复过多次了!!!

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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-11-15 10:30:21
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净

跑过电泳,有2200和2800的条带,并且2200的条带亮一些,并没有1000多的带。

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6楼2016-11-15 16:52:48
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

是做连接的问题吗,连接时20ul体系,质粒回收产物浓度50ng/ul,加入1ul,目的片段回收产物与质粒浓度比3~5:1左右

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2楼2016-11-14 20:18:54
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lingxfqibebt

木虫 (正式写手)

片段越小越容易连接上,切胶不干净,几个,片段相近不容易分离

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3楼2016-11-14 22:18:43
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:29
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:30
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净
4楼2016-11-15 10:30:21
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