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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化已有3人参与

道友们,请教一个问题,做质粒的重组实验,先将目的片段连入T载体,之后挑选序列正确的菌,提取质粒后,双酶切,得到三条长带(1200,2200,2800)(因为T载体上有相同的酶切位点),其中2200是目的片段,1200和2800为T载体上的。电泳切胶后,切得2200bp片段胶回收,然后连接入表达载体中,转化后,挑选阳性菌跑PCR。结果绝大多数条带是1200,还有2800的,测序是T载体上的,而我的目的条带却很少有?求教为什么啊,重复过多次了!!!

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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

是做连接的问题吗,连接时20ul体系,质粒回收产物浓度50ng/ul,加入1ul,目的片段回收产物与质粒浓度比3~5:1左右

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2楼2016-11-14 20:18:54
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lingxfqibebt

木虫 (小有名气)

片段越小越容易连接上,切胶不干净,几个,片段相近不容易分离

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3楼2016-11-14 22:18:43
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:29
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:07:30
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净
4楼2016-11-15 10:30:21
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, 有帮助 2016-11-25 10:08:12
是连接的问题吧,要不然就是回收的时候出现了问题

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···
5楼2016-11-15 11:46:35
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-11-15 10:30:21
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量,我觉得你应该是切胶没切好,回收的不干净

跑过电泳,有2200和2800的条带,并且2200的条带亮一些,并没有1000多的带。

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6楼2016-11-15 16:52:48
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这个问题比较复杂了,先想办法将2800bp的片段破坏,凝胶电泳2200和2800一般是不太好区分的,建议将2800bp的片段破坏,同时电泳的时候多跑一些时间在切胶。

或者采用第二个办法就是切pcr产物
7楼2016-11-16 10:39:06
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cry_2013

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Yuanfang_818 at 2016-11-15 16:52:48
跑过电泳,有2200和2800的条带,并且2200的条带亮一些,并没有1000多的带。
...

你测序结果是T载体上1200bp那一部分吗?凝胶成像仪照相的时候有没有把光圈调大或者曝光看看,确定一下1200那个位置是不是确实没条带,我还是觉得胶回收那的问题,因为我最近也遇到类似情况,我是想办法把杂带去除了,然后菌液PCR就有结果了,不过还没有测序,还不知道是不是阳性克隆。。。。
8楼2016-11-16 14:03:47
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