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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化 已有3人参与

道友们，请教一个问题，做质粒的重组实验，先将目的片段连入T载体，之后挑选序列正确的菌，提取质粒后，双酶切，得到三条长带(1200,2200,2800)(因为T载体上有相同的酶切位点)，其中2200是目的片段，1200和2800为T载体上的。电泳切胶后，切得2200bp片段胶回收，然后连接入表达载体中，转化后，挑选阳性菌跑PCR。结果绝大多数条带是1200，还有2800的，测序是T载体上的，而我的目的条带却很少有？求教为什么啊，重复过多次了！！！

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1楼 2016-11-14 20:08:17
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
是做连接的问题吗，连接时20ul体系，质粒回收产物浓度50ng/ul，加入1ul，目的片段回收产物与质粒浓度比3~5：1左右

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2楼2016-11-14 20:18:54
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lingxfqibebt

木虫 (小有名气)
片段越小越容易连接上，切胶不干净，几个，片段相近不容易分离

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3楼2016-11-14 22:18:43
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★有帮助 2016-11-25 10:07:29
Yuanfang_818: 金币+3, ★有帮助 2016-11-25 10:07:30
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量，我觉得你应该是切胶没切好，回收的不干净
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4楼2016-11-15 10:30:21
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+3, ★有帮助 2016-11-25 10:08:12
是连接的问题吧，要不然就是回收的时候出现了问题

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···
5楼2016-11-15 11:46:35
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-11-15 10:30:21
你切胶回收后有没有电泳看看回收的目的条带的质量，我觉得你应该是切胶没切好，回收的不干净

跑过电泳，有2200和2800的条带，并且2200的条带亮一些，并没有1000多的带。

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6楼2016-11-15 16:52:48
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个问题比较复杂了，先想办法将2800bp的片段破坏，凝胶电泳2200和2800一般是不太好区分的，建议将2800bp的片段破坏，同时电泳的时候多跑一些时间在切胶。

或者采用第二个办法就是切pcr产物
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7楼2016-11-16 10:39:06
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cry_2013

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Yuanfang_818 at 2016-11-15 16:52:48
跑过电泳，有2200和2800的条带，并且2200的条带亮一些，并没有1000多的带。
...

你测序结果是T载体上1200bp那一部分吗？凝胶成像仪照相的时候有没有把光圈调大或者曝光看看，确定一下1200那个位置是不是确实没条带，我还是觉得胶回收那的问题，因为我最近也遇到类似情况，我是想办法把杂带去除了，然后菌液PCR就有结果了，不过还没有测序，还不知道是不是阳性克隆。。。。
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8楼2016-11-16 14:03:47
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