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David_王

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2264004
注册: 2013-01-28
性别: MM
专业: 微生物药物

[求助] 求助，TA克隆卡了俩星期了，挑不到正确连接的阳性克隆！已有7人参与

目标是把重叠PCR获得的一个3kb的回收片段通过TA克隆连接到T载体上。PCR片段是通过Takara的高保真酶获得的，胶回收以后测得浓度是47ng/ul。将回收片段Taq酶加A尾（做的50ul的大体系，回收片段加了15ul，72℃延伸30min）。然后取了4.5ul的加A尾载体片段，加了0.5ul的pMD18-T，5ul的Solution 1
（Takara）16℃过夜连接。10ul连接体系全部转化DH5α感受态（康维世纪）涂Amp+板。板上几乎长满了，但挑出来摇过夜提质粒，电泳后发现大小

都在1300bp左右（考虑到质粒的超螺旋形态，应该都是空载体？）所以现在问题出在哪里？是overlap回收的PCR片段有问题吗？还是连接时回收片段和载体的比例有问题？求大神指点 /(ㄒoㄒ)/~~ 要毕业好着急~~~~~！

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1楼 2016-11-14 12:54:45

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涯天一方

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

8楼: Originally posted by 18721317208 at 2016-11-14 21:26:33
1.先加a尾，再胶回收，考虑到高保真酶的作用，建议头天做pcr，隔天加a。2.连接温度可以调整为22度过夜试试。3.一定要蓝白斑筛选，3000片段连接效率会非常低。正常情况就算提出质粒为空载，电泳检测应该也会在3000左 ...

我也遇到了质粒大小比实际小的问题，我想问是，我做完酶切后只切出一条带，理论是两条带才对，即使测序正确，回头做胶回收时用酶切还是直切一个条带呀