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15836073150

金虫 (小有名气)

[求助] hi-TAIL PCR问题 已有2人参与

我知道基因的编码区,想扩基因的启动子,然后做的hi-TAIL PCR,结果扩出来的片段非常短只有二三百bp,而且是这个基因的5’端,还不是启动子,请问有遇到这种问题的吗,该怎么解决啊。
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xihadream

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by longanzz at 2016-10-12 10:10:06
一点点向前移动,你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗?

你好!最近在做基因克隆,希望用转录组测序获得的CDS序列设计的引物,通过PCR获得基因的全长序列,应该怎么设计引物呢?
勿忘初心,持续改变
10楼2017-01-11 23:22:47
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longanzz

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
15836073150: 金币+2, 有帮助 2016-10-12 10:35:58
15836073150: 金币+2 2016-10-13 09:45:37
一点点向前移动,你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗?
2楼2016-10-12 10:10:06
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15836073150

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by longanzz at 2016-10-12 10:10:06
一点点向前移动,你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗?

谢谢您的回复,第一次做的时候是根据保守区设计的下游引物,结果扩出来了前面的内含子,后来在前面内含子区设计的下游引物,结果就扩出来了二三百bp的片段,而且不是启动子,这是什么原因啊。
3楼2016-10-12 10:35:55
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longanzz

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
15836073150: 金币+2 2016-10-13 09:45:44
可能是非编码区,你还是以基因组序列设计上下游引物比较好,一般都会得到启动子序列,就是长短的问题啊。
4楼2016-10-13 09:25:58
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star013

新虫 (知名作家)


我们可以提供该技术服务

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5楼2016-10-13 09:40:35
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wxb377515727

金虫 (小有名气)

你好,我现在也在做这个TAIL-PCR。你能告诉我你的这个PCR体系具体的量吗?
比如LAD加多少微升还有其他的?
故事是缓缓写到结局的
6楼2016-11-02 17:10:44
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15836073150

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wxb377515727 at 2016-11-02 17:10:44
你好,我现在也在做这个TAIL-PCR。你能告诉我你的这个PCR体系具体的量吗?
比如LAD加多少微升还有其他的?

第一轮:模板1微升,LAD1微升,sp1 0.3微升,MIX 10微升,水7.7微升
第二轮:模板1微升,AC 0.3    SP2  0.3  
第三轮:模板1微升,AC 0.6    sp3  0.6
我是按实验室师姐的体系加的,程序估计都差不多吧!可是我现在跑出来的还是太短,你做出来了有机会讨论讨论。

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7楼2016-11-03 14:33:56
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wxb377515727

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 15836073150 at 2016-11-03 14:33:56
第一轮:模板1微升,LAD1微升,sp1 0.3微升,MIX 10微升,水7.7微升
第二轮:模板1微升,AC 0.3    SP2  0.3  
第三轮:模板1微升,AC 0.6    sp3  0.6
我是按实验室师姐的体系加的,程序估计都差不多吧!可是我现 ...

还想问下,你的sp1.lad,ac1是多少微摩尔呢?

发自小木虫Android客户端
故事是缓缓写到结局的
8楼2016-11-03 19:11:37
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15836073150

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by wxb377515727 at 2016-11-03 19:11:37
还想问下,你的sp1.lad,ac1是多少微摩尔呢?
...

浓度吗,都是10

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9楼2016-11-03 19:12:08
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