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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » hi-TAIL PCR问题
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15836073150

金虫 (小有名气)

[求助] hi-TAIL PCR问题 已有2人参与

我知道基因的编码区，想扩基因的启动子，然后做的hi-TAIL PCR，结果扩出来的片段非常短只有二三百bp，而且是这个基因的5’端，还不是启动子，请问有遇到这种问题的吗，该怎么解决啊。
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1楼 2016-10-08 18:54:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xihadream

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longanzz at 2016-10-12 10:10:06
一点点向前移动，你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗？

你好！最近在做基因克隆，希望用转录组测序获得的CDS序列设计的引物，通过PCR获得基因的全长序列，应该怎么设计引物呢？
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勿忘初心，持续改变
10楼2017-01-11 23:22:47
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longanzz

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
15836073150: 金币+2, ★有帮助 2016-10-12 10:35:58
15836073150: 金币+2 2016-10-13 09:45:37
一点点向前移动，你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗？
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2楼2016-10-12 10:10:06
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15836073150

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longanzz at 2016-10-12 10:10:06
一点点向前移动，你是根据你基因的DNA序列设计的引物吗？

谢谢您的回复，第一次做的时候是根据保守区设计的下游引物，结果扩出来了前面的内含子，后来在前面内含子区设计的下游引物，结果就扩出来了二三百bp的片段，而且不是启动子，这是什么原因啊。
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3楼2016-10-12 10:35:55
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longanzz

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
15836073150: 金币+2 2016-10-13 09:45:44
可能是非编码区，你还是以基因组序列设计上下游引物比较好，一般都会得到启动子序列，就是长短的问题啊。
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4楼2016-10-13 09:25:58
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以提供该技术服务

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5楼2016-10-13 09:40:35
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wxb377515727

金虫 (小有名气)
你好，我现在也在做这个TAIL-PCR。你能告诉我你的这个PCR体系具体的量吗？
比如LAD加多少微升还有其他的？
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故事是缓缓写到结局的
6楼2016-11-02 17:10:44
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15836073150

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wxb377515727 at 2016-11-02 17:10:44
你好，我现在也在做这个TAIL-PCR。你能告诉我你的这个PCR体系具体的量吗？
比如LAD加多少微升还有其他的？

第一轮：模板1微升，LAD1微升，sp1 0.3微升，MIX 10微升，水7.7微升
第二轮：模板1微升，AC 0.3    SP2  0.3  
第三轮：模板1微升，AC 0.6    sp3  0.6
我是按实验室师姐的体系加的，程序估计都差不多吧！可是我现在跑出来的还是太短，你做出来了有机会讨论讨论。

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7楼2016-11-03 14:33:56
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wxb377515727

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 15836073150 at 2016-11-03 14:33:56
第一轮：模板1微升，LAD1微升，sp1 0.3微升，MIX 10微升，水7.7微升
第二轮：模板1微升，AC 0.3    SP2  0.3  
第三轮：模板1微升，AC 0.6    sp3  0.6
我是按实验室师姐的体系加的，程序估计都差不多吧！可是我现 ...

还想问下，你的sp1.lad，ac1是多少微摩尔呢？

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故事是缓缓写到结局的
8楼2016-11-03 19:11:37
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15836073150

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wxb377515727 at 2016-11-03 19:11:37
还想问下，你的sp1.lad，ac1是多少微摩尔呢？
...

浓度吗，都是10

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9楼2016-11-03 19:12:08
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