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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 小白一枚，求免疫共沉淀protocol
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liuyan7101

金虫 (正式写手)

[求助] 小白一枚，求免疫共沉淀protocol

本人小白，求免疫沉淀的详细protocol，我知道网上资源很多，可是我按照网上的方法做下来，该沉淀的样品中没有条带，反倒是阴性对照中的样品还有条带，感觉像是没有洗干净的样子，跪求大神，已经被折磨了几个月了，最好是有个视频啥的，答案好的另送100金币!@wizardfan@飞约疯人院
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1楼 2016-09-09 15:49:16
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hchen82

禁虫 (小有名气)
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liuyan7101
8楼2016-09-14 00:52:03
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普通回帖

土豆君

银虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-10 22:33:52
阴性本就应该有点条带，IP没条带，说明实验有问题，没拉到产物
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liuyan7101
爱基百客，提供专业级ChIP-seq、ATAC-seq、MeRIP-seq、RIP-seq等表观技术服务
2楼2016-09-10 21:25:39
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liuyan7101

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by 土豆君 at 2016-09-10 21:25:39
阴性本就应该有点条带，IP没条带，说明实验有问题，没拉到产物

是这样的，我没表达清楚，我的阴性对照是没有加bait的，只加了prey，但是用抗bait的抗体沉淀完以后，WB检测出了prey，而我的实验组是加了bait和prey的，沉淀完WB检测却没了prey，跪求指导~
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3楼2016-09-11 11:59:50
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hchen82

禁虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-11 21:07:34
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liuyan7101
4楼2016-09-11 13:14:47
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liuyan7101

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by hchen82 at 2016-09-11 13:14:47
用相应的protein A or igg-beads pre clear your extracts, then do your IP~~~~              
Make sure the negative exp has no bands, u can try different buffer and wash more times~~~~
...

谢谢，这个我试过了，就是在沉淀之前加入不加抗体的protein A（我实验用的是protein A）先预洗一遍，去掉beads，然后再往上清中加入有抗体的protein A进行沉淀，结果还是在没有加bait的样品中WB检测到了prey，您所说不同buffer之间的区别是指NaCl的浓度吗？其实现在最困惑我的问题是这个洗的过程，究竟该怎么洗，是加进去震荡，或者是在shaker上摇，或者是用手颠倒之类的，多久，几次，有没有个标准参考，或者视频教程啥的，总之，还是谢谢您的帮助~
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5楼2016-09-11 15:14:29
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以提供该技术服务

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6楼2016-09-12 13:42:39
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liuyan7101

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by star013 at 2016-09-12 13:42:39
我们公司可以提供该技术服务

呃。。。谢谢~
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7楼2016-09-13 09:19:30
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liuyan7101

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by hchen82 at 2016-09-14 00:52:03
WB 能检测到你的蛋白么？抗体用的是自身蛋白还是tag之类的！control里的带是对应的目的蛋白么？
Ps：提高氯化钠 和去污剂 多洗几次不用vortex!
...

我的全细胞裂解对照中都可以检测到，prey和bait都没问题，抗体用的都是tag，control里的带是prey，但是这个样品中没有bait，理论上prey是不应该被拉下来的。我的buffer中NaCl的浓度时200mM，那如果不用Vortex的话，该如何操作呢？谢谢你！
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9楼2016-09-14 11:54:12
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
你好！你也是在做免疫共沉淀吗？我是新手，希望能和你学点东西，谢谢！

发自小木虫IOS客户端
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10楼2016-10-24 10:27:40
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