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15871472357

金虫 (小有名气)

[交流] 反向PCR

我要从gDNA扩一个基因,怎么也扩不出来,然后文献用的是反向PCR法,可是我看了,还是不懂怎么操作的,求各位了解反向pcr的大神给翻译翻译,谢谢,小弟散金求结果,因为马上要开组会了
疑问:1、刚开始酶切gDNA用的是什么内切酶?
2、为什么后面加入25ul的反应体系,加的模板是3ul的环话模板,为什么不是第二次酶切的模板?
3、为什么gDNA要经过滤膜过滤?

反向PCR
360截图20160908152938371.jpg
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547star

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-21 16:19:26
不幸的是已知序列有swa1,我理解的是先用内切酶切开,然后t4环化,最后再用内切酶切开,就是这个swa1,所以这样的话,要的目的序列不就被切开了吗?求解...

这样换别的酶来切割后成环再在已知序列切割成线状也是可以的,处理之后,已知序列在线状DNA两侧,未知序列在中间,以已知序列部分设计引物进行PCR扩增,把PCR产物测序即可得到未知序列。
为什么
7楼2016-09-21 23:55:48
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star013

新虫 (知名作家)


xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:49:52
2楼2016-09-08 15:43:22
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15871472357

金虫 (小有名气)

xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:50:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-08 15:43:22
我们可以做

你们是公司吗?你们做的话多少钱?

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-09-08 20:55:53
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15871472357

金虫 (小有名气)

xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:51:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-08 20:55:53
你们是公司吗?你们做的话多少钱?
...

就只是扩个pcr,具体用什么方法随便,3.3k大小

发自小木虫IOS客户端
4楼2016-09-08 20:58:18
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