应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反向PCR
71/1返回列表
查看: 2483  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

15871472357

金虫 (小有名气)

[交流] 反向PCR

我要从gDNA扩一个基因，怎么也扩不出来，然后文献用的是反向PCR法，可是我看了，还是不懂怎么操作的，求各位了解反向pcr的大神给翻译翻译，谢谢，小弟散金求结果，因为马上要开组会了
疑问：1、刚开始酶切gDNA用的是什么内切酶？
2、为什么后面加入25ul的反应体系，加的模板是3ul的环话模板，为什么不是第二次酶切的模板？
3、为什么gDNA要经过滤膜过滤？

反向PCR
360截图20160908152938371.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-09-08 15:39:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

star013

新虫 (知名作家)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:49:52
我们可以做

发自小木虫Android客户端
回复此楼
2楼2016-09-08 15:43:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:50:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-08 15:43:22
我们可以做

你们是公司吗？你们做的话多少钱？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-09-08 20:55:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:51:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-08 20:55:53
你们是公司吗？你们做的话多少钱？
...

就只是扩个pcr，具体用什么方法随便，3.3k大小

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-09-08 20:58:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:41
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化，就成了一个类似质粒的环状DNA，可以从已知序列向两外侧扩增。扩增产物测序，找到酶切位点，比如参考文献的是SwaI，以此为止模拟切开，得到已知序列两外侧到酶切位点之间的序列信息。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
5楼2016-09-13 16:42:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2016-09-13 16:42:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化 ...

不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解
赞一下 回复此楼
6楼2016-09-21 16:19:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-21 16:19:26
不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解...

这样换别的酶来切割后成环再在已知序列切割成线状也是可以的，处理之后，已知序列在线状DNA两侧，未知序列在中间，以已知序列部分设计引物进行PCR扩增，把PCR产物测序即可得到未知序列。
赞一下 回复此楼
为什么
7楼2016-09-21 23:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 15871472357 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:44 by 4qO8zhfjr2AX
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 3/150 2026-08-29 21:35 by 4qO8zhfjr2AX
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:33 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 3/150 2026-08-29 21:32 by 4qO8zhfjr2AX
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 20:07 by winsaint
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 3/150 2026-08-29 18:59 by 4FFAWE8HcgUD
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭