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15871472357金虫 (小有名气)
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反向PCR
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我要从gDNA扩一个基因，怎么也扩不出来，然后文献用的是反向PCR法，可是我看了，还是不懂怎么操作的，求各位了解反向pcr的大神给翻译翻译，谢谢，小弟散金求结果，因为马上要开组会了 疑问：1、刚开始酶切gDNA用的是什么内切酶？ 2、为什么后面加入25ul的反应体系，加的模板是3ul的环话模板，为什么不是第二次酶切的模板？ 3、为什么gDNA要经过滤膜过滤？  360截图20160908152938371.jpg |
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3楼2016-09-08 20:55:53
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2楼2016-09-08 15:43:22
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4楼2016-09-08 20:58:18
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15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:41
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:50
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15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:41
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:50
| 反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化，就成了一个类似质粒的环状DNA，可以从已知序列向两外侧扩增。扩增产物测序，找到酶切位点，比如参考文献的是SwaI，以此为止模拟切开，得到已知序列两外侧到酶切位点之间的序列信息。 |
5楼2016-09-13 16:42:50