应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反向PCR
71/1返回列表
查看: 2343  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

15871472357

金虫 (小有名气)

[交流] 反向PCR

我要从gDNA扩一个基因，怎么也扩不出来，然后文献用的是反向PCR法，可是我看了，还是不懂怎么操作的，求各位了解反向pcr的大神给翻译翻译，谢谢，小弟散金求结果，因为马上要开组会了
疑问：1、刚开始酶切gDNA用的是什么内切酶？
2、为什么后面加入25ul的反应体系，加的模板是3ul的环话模板，为什么不是第二次酶切的模板？
3、为什么gDNA要经过滤膜过滤？

反向PCR
360截图20160908152938371.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-09-08 15:39:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

star013

新虫 (知名作家)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:49:52
我们可以做

发自小木虫Android客户端
回复此楼
2楼2016-09-08 15:43:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:50:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-08 15:43:22
我们可以做

你们是公司吗？你们做的话多少钱？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-09-08 20:55:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:51:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-08 20:55:53
你们是公司吗？你们做的话多少钱？
...

就只是扩个pcr，具体用什么方法随便，3.3k大小

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-09-08 20:58:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:41
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化，就成了一个类似质粒的环状DNA，可以从已知序列向两外侧扩增。扩增产物测序，找到酶切位点，比如参考文献的是SwaI，以此为止模拟切开，得到已知序列两外侧到酶切位点之间的序列信息。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
5楼2016-09-13 16:42:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15871472357

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2016-09-13 16:42:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化 ...

不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解
赞一下 回复此楼
6楼2016-09-21 16:19:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-21 16:19:26
不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解...

这样换别的酶来切割后成环再在已知序列切割成线状也是可以的，处理之后，已知序列在线状DNA两侧，未知序列在中间，以已知序列部分设计引物进行PCR扩增，把PCR产物测序即可得到未知序列。
赞一下 回复此楼
为什么
7楼2016-09-21 23:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 15871472357 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +6 jiajunX 2026-03-22 6/300 2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 考研调剂 +6 呼呼？~+123456 2026-03-24 6/300 2026-03-25 22:55 by 418490947
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 08工学调剂 +13 用户573181 2026-03-20 18/900 2026-03-25 22:00 by zbssa
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 303求调剂 +6 元夕元 2026-03-20 7/350 2026-03-25 12:00 by edmund7
[考研] 289求调剂 +9 怀瑾握瑜l 2026-03-20 9/450 2026-03-25 11:02 by userper
[考研] 求调剂 +5 林之夕 2026-03-24 5/250 2026-03-24 17:16 by dick_runner
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +4 曼111 2026-03-24 5/250 2026-03-24 15:44 by 星空星月
[考研] 一志愿河北工业大学0817化工278分求调剂 +7 jhybd 2026-03-23 12/600 2026-03-24 09:03 by jhybd
[考研] 求调剂 +7 十三加油 2026-03-21 7/350 2026-03-23 23:48 by 热情沙漠
[考研] 求老师收我 +3 zzh16938784 2026-03-23 3/150 2026-03-23 12:56 by ztnimte
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 303求调剂 +5 安忆灵 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:46 by 素颜倾城1988
[考研] 一志愿南大，0703化学，分数336，求调剂 +3 收到VS 2026-03-21 3/150 2026-03-21 18:42 by 学员8dgXkO
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 一志愿西安交通大学 学硕 354求调剂211或者双一流 +3 我想要读研究生 2026-03-20 3/150 2026-03-20 20:13 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭