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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反向PCR
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15871472357

金虫 (小有名气)

[交流] 反向PCR

我要从gDNA扩一个基因，怎么也扩不出来，然后文献用的是反向PCR法，可是我看了，还是不懂怎么操作的，求各位了解反向pcr的大神给翻译翻译，谢谢，小弟散金求结果，因为马上要开组会了
疑问：1、刚开始酶切gDNA用的是什么内切酶？
2、为什么后面加入25ul的反应体系，加的模板是3ul的环话模板，为什么不是第二次酶切的模板？
3、为什么gDNA要经过滤膜过滤？

反向PCR
360截图20160908152938371.jpg
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1楼 2016-09-08 15:39:45
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star013

新虫 (知名作家)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:49:52
我们可以做

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2楼2016-09-08 15:43:22
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15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:50:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by star013 at 2016-09-08 15:43:22
我们可以做

你们是公司吗？你们做的话多少钱？

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3楼2016-09-08 20:55:53
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15871472357

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 21:51:28
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-08 20:55:53
你们是公司吗？你们做的话多少钱？
...

就只是扩个pcr，具体用什么方法随便，3.3k大小

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4楼2016-09-08 20:58:18
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:41
15871472357: 金币+1 2016-09-21 16:19:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化，就成了一个类似质粒的环状DNA，可以从已知序列向两外侧扩增。扩增产物测序，找到酶切位点，比如参考文献的是SwaI，以此为止模拟切开，得到已知序列两外侧到酶切位点之间的序列信息。
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为什么
5楼2016-09-13 16:42:50
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15871472357

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2016-09-13 16:42:50
反向PCR一般用于从一段已知序列扩增两侧未知序列，参考文献选择SwaI是一个识别8个碱基的酶切位点，应该是在已知序列中不存在识别位点的酶，而且需要扩增的两侧序列比较长，才需要识别8的碱基的内切酶。酶切连接环化 ...

不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解
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6楼2016-09-21 16:19:26
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547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 15871472357 at 2016-09-21 16:19:26
不幸的是已知序列有swa1，我理解的是先用内切酶切开，然后t4环化，最后再用内切酶切开，就是这个swa1，所以这样的话，要的目的序列不就被切开了吗？求解...

这样换别的酶来切割后成环再在已知序列切割成线状也是可以的，处理之后，已知序列在线状DNA两侧，未知序列在中间，以已知序列部分设计引物进行PCR扩增，把PCR产物测序即可得到未知序列。
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为什么
7楼2016-09-21 23:55:48
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