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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化后全都消失没有了，求大神指导？
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白纯化后全都消失没有了，求大神指导？

做原核蛋白诱导，用的PET32a载体，诱导后，用 His融合标签蛋白纯化试剂盒【HIS*BIND PURIFICATION KIT His】进行纯化，结果纯化后所有蛋白带全都没有了，求大神指导？
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1楼 2016-09-05 15:24:18
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匿名
本帖仅楼主可见
2楼2016-09-05 15:57:04
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何琼杰

新虫 (小有名气)
★
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xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 22:47:40
我们最近也遇到了这个情况

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3楼2016-09-05 16:22:51
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-06 22:47:57
标签没暴露出来，蛋白没挂到柱子上，

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I am not a hero , but I served with heroes！
4楼2016-09-06 11:35:35
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沉默、颜泪

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-18 22:31:42
肉肉-rourou: 金币+1 2016-11-03 14:02:47
试着用分子筛纯化吧。最好做WB检测一下是否有你的目的蛋白。

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5楼2016-09-06 12:21:25
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2016-09-06 18:54:32
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Mr童先森

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-18 22:32:01
肉肉-rourou: 金币+3 2016-11-03 14:02:32
每次洗脱得收集液点样看看 蛋白在哪一步不见得 才能指定对策 可能wash buffer里面咪唑浓度高了 或者拍?

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进步
7楼2016-09-07 00:16:01
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Mr童先森

新虫 (正式写手)
或者ph低了 或者没有结合上 或者没有表达 或者his没有暴露

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进步
8楼2016-09-07 00:16:35
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shine372

木虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-09-18 22:32:15
肉肉-rourou: 金币+3 2016-11-03 14:02:16

首先你需要将菌体破碎后上清沉淀分别跑胶，确认蛋白是否可溶性表达；
其次纯化过程中取样，粗略计算样品中蛋白含量，再进行SDS-PAGE；
SDS-PAGE检测蛋白是有底限的，过少肯定没有条带
如果你的蛋白胶一片空白，连杂蛋白条带都没有，检查下你的SDS-PAGE是否操作正常
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9楼2016-09-07 11:21:53
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antelopeyy

金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-09-18 22:32:33
肉肉-rourou: 金币+3 2016-11-03 14:02:03
你可以一步一步排查情况，确定目的蛋白的去向：
1.首先SDS-PAGE确定目的蛋白是否在上清液，如果在上清液中，则进入第二步；
2.进行蛋白纯化，对纯化的流穿液和最后收集的纯化浓缩液和离心得到的滤出液都进行SDS-PAGE电泳；
若第一步中上清中没有目的蛋白，则目的蛋白没有可溶表达，需考虑表达问题；若流穿液中有目的蛋白，则表示没有挂柱，需则需要改变挂柱条件；若在滤出液中有目的蛋白，则可能超滤管本身有问题，需更换；
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10楼2016-09-18 22:00:30
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