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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 大家看看我这个质粒怎么了
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leannele

金虫 (小有名气)

[交流] 大家看看我这个质粒怎么了 已有5人参与

大家帮忙看看我这个质粒怎么了，全式金的T载体，大约4000bp，插入片段100bp左右。左边marker第一条带5000bp，第二条3000bp。菌液已经测序是正确的。提了两次总是在100bp左右有条带，可以确定试剂盒没问题。我想用他做定量PCR，扩增是失败的。

大家看看我这个质粒怎么了


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1楼 2016-08-20 12:21:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

leannele

金虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-21 08:03:14
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-08-20 12:39:47
RNA吧？质粒提取试剂盒里加RNase了吗。

加了，新买的试剂盒，全式金和天根都用过

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3楼2016-08-20 15:39:39
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aliaaxmu2016

金虫 (职业作家)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-21 21:52:51
建议如下：1.全程冰上做，减少非特异；2.看看能不能找个平行实验做一下？这样谁也不知道什么玩意。3.pcr污染，换掉所有pcr体系。我感觉非特异可能比较大，之前做人的基因组，这个位置总有明亮非特异

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leannele
4楼2016-08-21 14:59:28
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-21 08:03:07
RNA吧？质粒提取试剂盒里加RNase了吗。
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2楼2016-08-20 12:39:47
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leannele

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by aliaaxmu2016 at 2016-08-21 14:59:28
建议如下：1.全程冰上做，减少非特异；2.看看能不能找个平行实验做一下？这样谁也不知道什么玩意。3.pcr污染，换掉所有pcr体系。我感觉非特异可能比较大，之前做人的基因组，这个位置总有明亮非特异
...

谢谢，明天试试

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5楼2016-08-21 22:14:27
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Harper_sun


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6楼2016-08-22 08:02:14
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你提其他质粒正常吗？是不是裂解时混匀太剧烈了或者裂解时间过长？100bp条带这么亮，不太正常啊。

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leannele
7楼2016-08-24 17:28:47
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leannele

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 梅太奇阿拉干 at 2016-08-24 17:28:47
你提其他质粒正常吗？是不是裂解时混匀太剧烈了或者裂解时间过长？100bp条带这么亮，不太正常啊。

这张图是不同的菌液提的。如果跑胶时间长点就没有下边的条带了，应该是RNA污染吧

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8楼2016-08-24 20:35:11
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梅太奇阿拉干

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by leannele at 2016-08-24 20:35:11
这张图是不同的菌液提的。如果跑胶时间长点就没有下边的条带了，应该是RNA污染吧
...

Rna是非常不稳定的，如果是rna条带周围应该是有一些弥带的，不会是很亮的一条，100bp的片段同浓度下比4000bp片段是暗很多的，你的这个小片段比质粒的条带都亮，说明浓度比质粒还大(正常情况下质粒比rna稳定的多，不可能条带比rna弱)，所以不太正常，而且你也加了RNa酶，所以不太可能是rna,你换一个其他质粒，不含这个重组质粒的菌提一下，看看是不是也这样，如果是，那就可能是你操作或者试剂盒的问题了，如果不是，那就是构建的菌有问题

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leannele
9楼2016-08-25 11:45:36
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547star

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做定量的模板？100bp这么小的片段，大质粒无法判断克隆了没有，还有图片的就像前面的朋友说的应该是RNA。选择质粒越小越好。如果不用测序，建议pUC18用PvuII酶切得到2.3kb的小载体片段，加T后进行TA克隆，筛选白菌落。或者片段是不加A的进行平端克隆，如果片段没有PvuII识别位点，可以在连接体系加点PvuII酶。
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leannele
为什么
10楼2016-08-25 15:49:12
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