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baishaoyun新虫 (小有名气)
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重组质粒构建一直失败 已有4人参与
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我最近在做原核表达方面的实验，之前老师已经构建好了重组质粒，但诱导表达时诱导后和未诱导时表达量并无差别，因为做的是跨膜蛋白胞外段重组表达，就重新设计引物切除了临近跨膜区的六个碱基重新构建重组质粒，但每次酶切胶回收，连接，转化，最后菌液PCR鉴定都是阴性，或者弱阳性而提取质粒鉴定为阴性结过，担心PCR产物片段的双酶切可能效果不好，就连了T载体送公司测序验证正确后再双酶切做，然后与相同双酶切的pet28a-EGFP质粒连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，依然是每次菌液PCR鉴定都无目的条带出现，而作为对照的连接T载体的重组质粒转化菌菌液PCR鉴定强阳性，前前后后总共做了十多次都没有成功，求大神帮忙分析下可能的问题所在。 @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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baishaoyun
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【答案】应助回帖
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长出来的菌落现在怀疑是原来的重组质粒目的片段没切下来又发生了自连，有做菌液PCR弱阳性而提质粒阴性的怀疑目的片段导入了菌体但不能自我复制可能。载体和目的前段比例问题也考虑过，并尝试过1 :3到1:10之间的多个比例做连接，但始终不得阳性结果。双酶切电泳胶回收的条带是可以肯定确实都切下来了并且条带亮度很好，回收后浓度也都能达到40-150ng/ul之间 发自小木虫Android客户端 |
4楼2016-08-04 12:12:48
baishaoyun
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原来构建了三种pET28a-目的基因-EGFP重组质粒转化菌，另外两种诱导后表达量都明显增高，就现在打算重新构建的这个当时表达量很低。目的片段是和另外两种重组质粒中的一种经相同双酶切(Sac I和Noc I)胶回收后连接转化的。内切酶和连接酶都用的TAKARA的 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-08-04 11:58:03
baishaoyun
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怀疑过连接酶或连接酶失效的问题，后来都换了新的重新做过了，感受态，抗生素也重新买了做也是不行，每次培养也都有菌落出现，但菌液PCR鉴定要么阴性，要么显示弱阳性而提取质粒行PCR鉴定无条带同时双酶切切不下来目的条带。最近做的有一次提质粒PCR有弱条带，但双酶切鉴定还是没切下来目的条带。已经做了三个多月了可，实在是很无助呀 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-08-04 12:04:37
5楼2016-08-04 13:26:27
mcy883
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可以换NEB的T4连接酶试试 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-08-04 14:08:07
7楼2016-08-04 14:42:07
baishaoyun
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一起做的三个跨膜蛋白基因胞外段的原核表达，除了现在打算重新构建的一个，另外两个构建好的表达都可以，也都送公司测序过的，应该不会有问题吧 发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-08-04 17:41:26
baishaoyun
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目的基因，之前老师已经做过整个蛋白的表达的，表达量可以的。现在让我做的是这个蛋白胞外段的表达，应该不存在毒性问题吧。引物的话，连接T载体和目的基因的重组质粒转化菌做的阳性对照电泳条带很明显的，应该不会有多大问题吧？我也想过菌液PCR有可能不准确，也尝试过提取质粒鉴定，一样的不行呢。有一次的做质粒PCR有弱条带，里边会不会有可能混有少量重组质粒呢？ 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-08-04 17:52:23
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因为你是同时做的三个载体 所以如果只有一个有问题的话 可能这个目的片段出问题的几率大一点 我看楼上说表达的蛋白有毒性 这个可能性也很大 不如你查查文献 看看有没有类似的情况？ 发自小木虫Android客户端 |
10楼2016-08-04 18:07:56