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baishaoyun

新虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:55
引用回帖:
18楼: Originally posted by 流水遇行云 at 2016-08-06 00:21:11
酶切位点选择合适吗,链接时间多长,目的片段是不是太长,导致连接难度太大

连接时间按说明书的16摄氏度半个小时连过,也过夜连接过,都不行。目的片段不到700bp

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21楼2016-08-06 12:41:52
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:03
1、首先分别确定你的目的片段和载体的酶切位点是没有问题的。2、做连接时做个自连对照,如果自连的也长了那说明你质粒酶切不完全,因为你T载体连过,测序也正确,而你的目的片段也不大,所以很可能就是质粒酶切不好,有假阳性。祝好!

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22楼2016-08-06 20:42:33
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sonny

金虫 (著名写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:08
抗性基因在DH5a里表达是因为它与目的基因所用的启动子不同!

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23楼2016-08-07 00:18:09
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sxxuan

金虫 (著名写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:16
看下载体的强弱,有时候不一定需要严格按照比例连接。如果同时做的所有都没有问题,就只能把问题集中在唯一变化的因素,就是pcr片段,或你说已经构建到t载体中?这样再从双酶切,纯化等一步步验证分析

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你的日子如何,你的力量也必如何!
24楼2016-08-07 07:57:15
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samantha_90

木虫 (正式写手)

xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:21
请问最后做出来了吗?我现在也遇到同样的问题,同一个vector,其他三个都连上了,就这一个不对,试了双切酶连接和Gibson,都不行,控制板上也没有菌落,都想不到什么原因了,还请赐教
25楼2016-09-30 10:28:15
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baishaoyun

新虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:28
引用回帖:
25楼: Originally posted by samantha_90 at 2016-09-30 10:28:15
请问最后做出来了吗?我现在也遇到同样的问题,同一个vector,其他三个都连上了,就这一个不对,试了双切酶连接和Gibson,都不行,控制板上也没有菌落,都想不到什么原因了,还请赐教

你好,我的应该是连接酶的问题,原来都用的TAKARA的连接酶,中间做不出来更换了一种也还是Takara的,后来借实验室一学姐总剩下的天根的连接酶一下子就做出来了

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26楼2016-10-01 00:16:16
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