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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒构建一直失败
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:55
引用回帖:
18楼: Originally posted by 流水遇行云 at 2016-08-06 00:21:11
酶切位点选择合适吗，链接时间多长，目的片段是不是太长，导致连接难度太大

连接时间按说明书的16摄氏度半个小时连过，也过夜连接过，都不行。目的片段不到700bp

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21楼2016-08-06 12:41:52
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:03
1、首先分别确定你的目的片段和载体的酶切位点是没有问题的。2、做连接时做个自连对照，如果自连的也长了那说明你质粒酶切不完全，因为你T载体连过，测序也正确，而你的目的片段也不大，所以很可能就是质粒酶切不好，有假阳性。祝好！

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22楼2016-08-06 20:42:33
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sonny

金虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:08
抗性基因在DH5a里表达是因为它与目的基因所用的启动子不同！

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23楼2016-08-07 00:18:09
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:16
看下载体的强弱，有时候不一定需要严格按照比例连接。如果同时做的所有都没有问题，就只能把问题集中在唯一变化的因素，就是pcr片段，或你说已经构建到t载体中？这样再从双酶切，纯化等一步步验证分析

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你的日子如何，你的力量也必如何！
24楼2016-08-07 07:57:15
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samantha_90

木虫 (正式写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:21
请问最后做出来了吗？我现在也遇到同样的问题，同一个vector，其他三个都连上了，就这一个不对，试了双切酶连接和Gibson，都不行，控制板上也没有菌落，都想不到什么原因了，还请赐教
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25楼2016-09-30 10:28:15
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:33:28
引用回帖:
25楼: Originally posted by samantha_90 at 2016-09-30 10:28:15
请问最后做出来了吗？我现在也遇到同样的问题，同一个vector，其他三个都连上了，就这一个不对，试了双切酶连接和Gibson，都不行，控制板上也没有菌落，都想不到什么原因了，还请赐教

你好，我的应该是连接酶的问题，原来都用的TAKARA的连接酶，中间做不出来更换了一种也还是Takara的，后来借实验室一学姐总剩下的天根的连接酶一下子就做出来了

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26楼2016-10-01 00:16:16
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