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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒构建一直失败
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 21:08:03
可能是没有连接上
测序后检查酶切位点是否还在
另外，是否还有别的位点和你使用的位点重复？
如果这样，可能存在切下来的带极小而肉眼看不到。
还可以试试酶切补平再连接
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11楼2016-08-04 18:40:55
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star013

新虫 (知名作家)
xn8008: 违规存档 2016-10-01 07:27:27
我们可以帮您构建

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12楼2016-08-05 15:14:43
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:31:44
引用回帖:
11楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-08-04 18:40:55
可能是没有连接上
测序后检查酶切位点是否还在
另外，是否还有别的位点和你使用的位点重复？
如果这样，可能存在切下来的带极小而肉眼看不到。
还可以试试酶切补平再连接

是没连接上，但就是不知道问题出在哪了。序列上其他位置不含这两个酶切位点的

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13楼2016-08-05 19:34:49
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:31:53
引用回帖:
10楼: Originally posted by 十四_14 at 2016-08-04 18:07:56
因为你是同时做的三个载体  所以如果只有一个有问题的话  可能这个目的片段出问题的几率大一点  我看楼上说表达的蛋白有毒性  这个可能性也很大  不如你查查文献  看看有没有类似的情况？
...

第一次构建的测序没问题，但诱导后表达量没增加，是怀疑过会不会临近跨膜区的氨基酸疏水，翻译时与EGFP上的亲水性氨基酸连接受影响。现在是重新构建重组质粒都不能成功的

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14楼2016-08-05 19:38:42
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by mcy883 at 2016-08-04 14:08:07
可以换NEB的T4连接酶试试

这个现在是有必要尝试下了

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15楼2016-08-05 19:39:37
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:07
引用回帖:
12楼: Originally posted by star013 at 2016-08-05 15:14:43
我们可以帮您构建

我觉得找出问题所在才是关键，当初没想着找公司做，老师就是想让我锻炼下自己的

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16楼2016-08-05 19:40:44
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:14
xn8008: 应助指数+1 2016-10-01 07:32:20
今天我也遇到了这样的问题。同一批的克隆，一样的酶切位点，唯一的不同就是基因不同，就是这么一个克隆不出来。用酶切检测质粒，完全切不动，跑出来就是超螺旋。就算是载体没有切干净也不会出现超螺旋啊，这就让我很纳闷了，实在不知道怎么办。
和你情况也很类似，这个基因也是重新克隆，不过我是要换个tag，以前能克隆出来（依旧记得那次很艰难），这次不行了。
会不会是酶切位点被甲基化了，酶无法识别？不然怎么解释超螺旋现象?
楼主可以试试无缝克隆。
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欢迎讨论，小木虫未能及时回复，请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
17楼2016-08-05 23:26:12
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流水遇行云

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:27
酶切位点选择合适吗，链接时间多长，目的片段是不是太长，导致连接难度太大

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18楼2016-08-06 00:21:11
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sonny

金虫 (著名写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:35
引用回帖:
9楼: Originally posted by baishaoyun at 2016-08-04 17:52:23
目的基因，之前老师已经做过整个蛋白的表达的，表达量可以的。现在让我做的是这个蛋白胞外段的表达，应该不存在毒性问题吧。引物的话，连接T载体和目的基因的重组质粒转化菌做的阳性对照电泳条带很明显的，应该不会 ...

DH5a为直接扩增所用，质粒上的基因根本不会表达！

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19楼2016-08-06 07:01:57
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-01 07:32:42
引用回帖:
19楼: Originally posted by sonny at 2016-08-06 07:01:57
DH5a为直接扩增所用，质粒上的基因根本不会表达！
...

表达还是有的，不然质粒上的抗生素抗性基因怎么起作用呢，只是表达量不高而已

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20楼2016-08-06 12:40:24
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