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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 农杆菌转化后菌落PCR就是不出目的条带，求助。
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damaoouba

木虫 (正式写手)

[求助] 农杆菌转化后菌落PCR就是不出目的条带，求助。 已有3人参与

事情是这样的。

目的片段连载体，提取质粒后质粒送测序，没有问题。
然后质粒转农杆菌，4天长出菌落。
挑菌划线后进行菌落PCR，但是就是没有目的条带。。。
咋回事呢？？？？可能是哪一步出了问题？？
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1楼 2016-07-06 14:35:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
菌落PCR的时候最好把菌放在无菌水里煮一下，离心，取上清做模板
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3楼2016-07-06 16:04:39
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 鼓励发帖交流 2016-07-07 08:30:51
四天才长出菌落？假阳性吧。长的菌落提质粒了吗？农杆菌的感受态确定没有问题吗？确定没有问题的话，建议重新转化。
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2楼2016-07-06 14:40:23
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普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这太笼统了，把你实验的过程和实验的对照都写出来呀。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2016-07-06 16:44:46
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damaoouba

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2016-07-06 16:04:39
菌落PCR的时候最好把菌放在无菌水里煮一下，离心，取上清做模板

这是为什么呢？？
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5楼2016-07-07 08:44:22
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damaoouba

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-06 14:40:23
四天才长出菌落？假阳性吧。长的菌落提质粒了吗？农杆菌的感受态确定没有问题吗？确定没有问题的话，建议重新转化。

恩，怀疑假阳性，农杆菌感受态没有问题，正要重新转化。谢谢。
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6楼2016-07-07 08:45:09
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damaoouba

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2016-07-06 16:44:46
你这太笼统了，把你实验的过程和实验的对照都写出来呀。

双酶切后目的片段连载体3301.
转化大肠杆菌，提取质粒，质粒测序有目的片段。
质粒浓度不高，400+吧，转农杆菌，50ul农杆菌加了5ul质粒。
常规方法转了农杆菌，画板，kana抗性加利福平。
4天长出菌斑，就长了4个。
然后划线长得也比较慢，菌落PCR,直接挑菌做的。。
没有放对照。。
我应该在PCR的时候放什么对照呢？？
分子还是比较弱的。。。还请多指点

谢谢啦。
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7楼2016-07-07 08:47:52
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般经验是：
1、农杆菌转化后会长出很多菌落
2、放置在28℃环境2天即可长出
3、电击转化时是否出现炸杯现象
     这样可能导致没有转入成功
4、0.5ul质粒加入50ul感受态转化
5、若保证每个环节没问题，
     那么挑菌提质粒再做PCR，
     因为有的菌拷贝数很低
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8楼2016-07-07 09:15:43
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阿尔卑斯英

新虫 (初入文坛)
四天才长出来，非目的菌落，建议重新做吧
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9楼2016-07-07 11:21:11
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zyfskj

新虫 (著名写手)
质粒没转进去啊

发自小木虫Android客户端
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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
10楼2016-07-08 13:07:39
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