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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

[求助] 急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？ 已有9人参与

最近一直在纯化蛋白，用的镍柱纯化。平衡，洗杂缓冲液A 是用的50mM的乙酸钠缓冲液，500mM氯化钠，20mM咪唑
洗脱缓冲液B 用的是50mM的乙酸钠缓冲液，500mM氯化钠，500mM咪唑
之前洗脱是用的线性洗脱，但是一直有杂带。
这次先用的低浓度咪唑洗，再用的高浓度的咪唑洗，发现5%的 B洗脱缓冲液就可以洗下来，结合能力太弱。请问大神们，问题出在哪里，要怎么样做才可以纯出比较单一的目的蛋白（只想用镍柱），谢谢了

急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？


急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？-1


急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？-2


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1楼 2016-06-26 22:47:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yvonne_mi

木虫 (正式写手)
上样和洗脱pH很重要 你目前的洗脱体系15%就可以把你的目的蛋白洗出来  设置0～15%B 洗脱时间长一点 看看能不能分出来 如果还是不纯的话 更换下缓冲液pH 其实纯化就那么几个条件 你就反复摸索。会找到合适的条件的

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4楼2016-06-28 15:47:16
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xu5606587

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

醋酸缓冲液调到7 ，不在缓冲范围了吧？流出液pH测定下看看，可以尝试其他缓冲体系。
另外就是他们说的上样平衡液不加咪唑
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恬淡
15楼2016-07-04 16:13:20
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

亲，就算是亲和镍柱也不是说100%纯化纯度，总会有杂蛋白这是必然。关键看你要的目的蛋白是想纯度优先还是数量优先。从你的出峰图和电泳图来看，在5%~10%浓度的洗脱液洗脱下来的纯度是较好，既然低浓度的就可以洗下来，干嘛还要高浓度。我的认识是你用高浓度是想获得更高的收率不知道是不是。纯度和量二者难兼得。纯度第一的话，到达你想要的纯度标准你就不要再加洗脱浓度了，就算你为了收率加洗脱浓度，最后下来有咋蛋白得不偿失。
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24楼2016-08-15 14:53:51
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普通回帖

一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
我的目的蛋白是45kDa的那条带

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2楼2016-06-26 22:49:18
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
缓冲液PH是多少了。目前的过程没什么大问题。上样完后，用A液要淋洗，目的是把没结合的蛋白冲出柱子，彻底淋洗，然后拉咪唑梯度洗脱。梯度慢些
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3楼2016-06-27 11:04:50
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milamiya

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2016-06-29 14:36:43
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by milamiya at 2016-06-29 14:36:43
buffer A不加咪唑试试，还有就是把pH值适当调高一点。

谢谢了，不加的也试过 ，也是有杂带
ph高了我的蛋白会失活

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6楼2016-06-29 20:17:09
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-27 11:04:50
缓冲液PH是多少了。目前的过程没什么大问题。上样完后，用A液要淋洗，目的是把没结合的蛋白冲出柱子，彻底淋洗，然后拉咪唑梯度洗脱。梯度慢些

ph是7

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7楼2016-06-29 20:17:59
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yvonne_mi at 2016-06-28 15:47:16
上样和洗脱pH很重要 你目前的洗脱体系15%就可以把你的目的蛋白洗出来  设置0～15%B 洗脱时间长一点 看看能不能分出来 如果还是不纯的话 更换下缓冲液pH 其实纯化就那么几个条件 你就反复摸索。会找到合适的条件的
...

好的，我试试，谢谢了

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8楼2016-06-29 20:18:14
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
没挂柱子

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9楼2016-06-29 21:07:24
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

没看到你FT的样品，会不会本身挂柱效果就不好，还有A buffer可以试试把咪唑去掉，虽然这样可以去除一部分杂蛋白，但是也会影响目的蛋白结合柱子，4楼说的线性洗脱也可以试试，还有Ph是7的话应该用Tris-HCl缓冲吧，乙酸缓冲应该是酸性缓冲体系。
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10楼2016-06-30 09:55:43
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