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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

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10楼: Originally posted by chlorella409 at 2016-06-30 09:55:43
没看到你FT的样品,会不会本身挂柱效果就不好,还有A buffer可以试试把咪唑去掉,虽然这样可以去除一部分杂蛋白,但是也会影响目的蛋白结合柱子,4楼说的线性洗脱也可以试试,还有Ph是7的话应该用Tris-HCl缓冲吧,乙 ...

tris试过,挂拄效率太低,我的也用不了pb。我准备试试你们建议的方法,谢谢

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11楼2016-06-30 16:14:11
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-27 11:04:50
缓冲液PH是多少了。目前的过程没什么大问题。上样完后,用A液要淋洗,目的是把没结合的蛋白冲出柱子,彻底淋洗,然后拉咪唑梯度洗脱。梯度慢些

谢谢了,ph是7   A液洗的时间很长了,大概15cv了。梯度具体要怎么设呢?

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12楼2016-07-02 19:21:05
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

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9楼: Originally posted by biosci at 2016-06-29 21:07:24
没挂柱子

确实,挂柱子效率感觉很低

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13楼2016-07-02 19:21:38
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一只毛毛虫

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5楼: Originally posted by milamiya at 2016-06-29 14:36:43
buffer A不加咪唑试试,还有就是把pH值适当调高一点。

谢谢了

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14楼2016-07-02 19:22:21
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xu5606587

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

醋酸缓冲液调到7 ,不在缓冲范围了吧?流出液pH测定下看看,可以尝试其他缓冲体系。
另外就是他们说的上样平衡液不加咪唑
恬淡
15楼2016-07-04 16:13:20
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by xu5606587 at 2016-07-04 16:13:20
醋酸缓冲液调到7 ,不在缓冲范围了吧?流出液pH测定下看看,可以尝试其他缓冲体系。
另外就是他们说的上样平衡液不加咪唑

好的谢谢了

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16楼2016-07-04 16:25:24
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

换tris-盐酸buffer,用醋酸钠不行。根本不在缓冲区间。
pH在往上调点到至少7.5最好接近8. 咪唑的pKa都有7左右,而与Ni结合需要不带电的咪唑。你的tag上的咪唑与Ni在pH=7条件下结合肯定不理想的。
17楼2016-07-05 18:33:59
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

内容已删除
18楼2016-07-06 10:49:48
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 一只毛毛虫 at 2016-07-06 10:49:48
我的目的蛋白在pH8以上就会失活了。听说tris会降低结合效率,是吗?
...

那你就不要超过pH8啦,tris降低效率我反正没遇到过。可以用磷酸盐缓冲啊。
19楼2016-07-06 19:01:41
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
19楼: Originally posted by xuweitao at 2016-07-06 19:01:41
那你就不要超过pH8啦,tris降低效率我反正没遇到过。可以用磷酸盐缓冲啊。...

我的目的蛋白的是酶,测酶活时的产物是磷酸二氢钾,所以不能用PB。以后就用tris吧!最近重新构建了一个,把his调到了N端,不知道会不会好点

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20楼2016-07-07 16:12:52
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