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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by chlorella409 at 2016-06-30 09:55:43
没看到你FT的样品，会不会本身挂柱效果就不好，还有A buffer可以试试把咪唑去掉，虽然这样可以去除一部分杂蛋白，但是也会影响目的蛋白结合柱子，4楼说的线性洗脱也可以试试，还有Ph是7的话应该用Tris-HCl缓冲吧，乙 ...

tris试过，挂拄效率太低，我的也用不了pb。我准备试试你们建议的方法，谢谢

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11楼2016-06-30 16:14:11
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by hc-material at 2016-06-27 11:04:50
缓冲液PH是多少了。目前的过程没什么大问题。上样完后，用A液要淋洗，目的是把没结合的蛋白冲出柱子，彻底淋洗，然后拉咪唑梯度洗脱。梯度慢些

谢谢了，ph是7   A液洗的时间很长了，大概15cv了。梯度具体要怎么设呢？

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12楼2016-07-02 19:21:05
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by biosci at 2016-06-29 21:07:24
没挂柱子

确实，挂柱子效率感觉很低

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13楼2016-07-02 19:21:38
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by milamiya at 2016-06-29 14:36:43
buffer A不加咪唑试试，还有就是把pH值适当调高一点。

谢谢了

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14楼2016-07-02 19:22:21
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xu5606587

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

醋酸缓冲液调到7 ，不在缓冲范围了吧？流出液pH测定下看看，可以尝试其他缓冲体系。
另外就是他们说的上样平衡液不加咪唑
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恬淡
15楼2016-07-04 16:13:20
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xu5606587 at 2016-07-04 16:13:20
醋酸缓冲液调到7 ，不在缓冲范围了吧？流出液pH测定下看看，可以尝试其他缓冲体系。
另外就是他们说的上样平衡液不加咪唑

好的谢谢了

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16楼2016-07-04 16:25:24
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

换tris-盐酸buffer，用醋酸钠不行。根本不在缓冲区间。
pH在往上调点到至少7.5最好接近8. 咪唑的pKa都有7左右，而与Ni结合需要不带电的咪唑。你的tag上的咪唑与Ni在pH=7条件下结合肯定不理想的。
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17楼2016-07-05 18:33:59
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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18楼2016-07-06 10:49:48
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 一只毛毛虫 at 2016-07-06 10:49:48
我的目的蛋白在pH8以上就会失活了。听说tris会降低结合效率，是吗？
...

那你就不要超过pH8啦，tris降低效率我反正没遇到过。可以用磷酸盐缓冲啊。
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19楼2016-07-06 19:01:41
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by xuweitao at 2016-07-06 19:01:41
那你就不要超过pH8啦，tris降低效率我反正没遇到过。可以用磷酸盐缓冲啊。...

我的目的蛋白的是酶，测酶活时的产物是磷酸二氢钾，所以不能用PB。以后就用tris吧！最近重新构建了一个，把his调到了N端，不知道会不会好点

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20楼2016-07-07 16:12:52
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