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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 急，镍柱纯化蛋白，很低浓度的咪唑就冲下来了，有杂带。怎么办？
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napoleonmeng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

蛋白本身挂柱效果不好的话可以尝试再添加几个HIS
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21楼2016-07-21 14:31:13
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磁珠

新虫 (初入文坛)
pH7.4,清洗咪唑浓度有点低

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22楼2016-08-03 16:34:22
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马朋雨

金虫 (正式写手)
洗脱前的浓度设几个剃度试试

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23楼2016-08-03 17:42:25
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

亲，就算是亲和镍柱也不是说100%纯化纯度，总会有杂蛋白这是必然。关键看你要的目的蛋白是想纯度优先还是数量优先。从你的出峰图和电泳图来看，在5%~10%浓度的洗脱液洗脱下来的纯度是较好，既然低浓度的就可以洗下来，干嘛还要高浓度。我的认识是你用高浓度是想获得更高的收率不知道是不是。纯度和量二者难兼得。纯度第一的话，到达你想要的纯度标准你就不要再加洗脱浓度了，就算你为了收率加洗脱浓度，最后下来有咋蛋白得不偿失。
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24楼2016-08-15 14:53:51
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MR_zang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

把bufferA  的咪唑去掉，然后上样后，检测你的穿透，如果在穿透中你的蛋白就下来的话  说明1：标签没有暴露2柱子填料与蛋白结合力不行。如果蛋白没有下来，就把线性洗脱的梯度拉的长一点试试
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25楼2016-09-02 17:15:17
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淡薄明月

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

想用一种纯化方法就获得单一的蛋白，你的想法不切实际，一般至少2种方法才行。Ni亲和层析的选择性并没有你想像的那么高，杂蛋白一样可以挂柱。你如果需要的量不大的话，可以加一步脱盐后进行离子交换尝试一下
。
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26楼2016-09-10 17:33:36
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飞翔的吉大人

新虫 (初入文坛)
你的平衡缓冲液加了咪唑？加了咪唑挂柱自然低了。。

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27楼2016-10-08 13:23:51
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

样品的pH要同柱子平衡液的缓冲尽量保持一致，如果挂柱不好可以提高样品的盐浓度。洗脱缓冲可以多设几个咪唑的梯度，60mM、250mM。
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28楼2016-10-09 09:46:35
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