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napoleonmeng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

蛋白本身挂柱效果不好的话可以尝试再添加几个HIS
21楼2016-07-21 14:31:13
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磁珠

新虫 (初入文坛)

pH7.4,清洗咪唑浓度有点低

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22楼2016-08-03 16:34:22
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马朋雨

金虫 (正式写手)

洗脱前的浓度设几个剃度试试

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23楼2016-08-03 17:42:25
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家


【答案】应助回帖

亲,就算是亲和镍柱也不是说100%纯化纯度,总会有杂蛋白这是必然。关键看你要的目的蛋白是想纯度优先还是数量优先。从你的出峰图和电泳图来看,在5%~10%浓度的洗脱液洗脱下来的纯度是较好,既然低浓度的就可以洗下来,干嘛还要高浓度。我的认识是你用高浓度是想获得更高的收率不知道是不是。纯度和量二者难兼得。纯度第一的话,到达你想要的纯度标准你就不要再加洗脱浓度了,就算你为了收率加洗脱浓度,最后下来有咋蛋白得不偿失。
24楼2016-08-15 14:53:51
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MR_zang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

把bufferA  的咪唑去掉,然后上样后,检测你的穿透,如果在穿透中你的蛋白就下来的话  说明1:标签没有暴露2柱子填料与蛋白结合力不行。如果蛋白没有下来,就把线性洗脱的梯度拉的长一点试试
25楼2016-09-02 17:15:17
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淡薄明月

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

想用一种纯化方法就获得单一的蛋白,你的想法不切实际,一般至少2种方法才行。Ni亲和层析的选择性并没有你想像的那么高,杂蛋白一样可以挂柱。你如果需要的量不大的话,可以加一步脱盐后进行离子交换尝试一下
26楼2016-09-10 17:33:36
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飞翔的吉大人

新虫 (初入文坛)

你的平衡缓冲液加了咪唑?加了咪唑挂柱自然低了。。

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27楼2016-10-08 13:23:51
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

样品的pH要同柱子平衡液的缓冲尽量保持一致,如果挂柱不好可以提高样品的盐浓度。洗脱缓冲可以多设几个咪唑的梯度,60mM、250mM。
28楼2016-10-09 09:46:35
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