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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

[求助] 请问蛋白镍柱纯化之后，elution buffer洗脱下来的蛋白跟之前没什么区别是怎么回事 已有5人参与

请问蛋白镍柱纯化之后，elution buffer洗脱下来的蛋白跟之前没什么区别是怎么回事

是生工的这种镍柱

请问蛋白镍柱纯化之后，elution buffer洗脱下来的蛋白跟之前没什么区别是怎么回事-1

先用bind/wash buffer平衡2h
之后加入样品（大肠杆菌细胞破碎后的上清），静置半小时后，流出的液体是右边第二个泳道的
然后wash buffer洗脱两次
最后加入elution buffer，静置半小时后得到纯化样品

3个样品分别进行了SDS-PAGE看了一下
结果发现基本上没有什么太大的变化，还是那些杂蛋白

试剂盒时间有点长，14年买的，但是我再生过，不过bind/wash buffer和elution buffer没有处理过
是这两个的问题吗？

一直纯化不成功，很苦恼，希望知道的朋友能够帮助一下！非常感谢！
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1楼 2016-06-20 15:34:42
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wochong

新虫 (小有名气)
原因有很多，可以看文章：蛋白纯化经验总结：http://www.detaibio.com/topics/qin-he-chun-hua-faq.html
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2楼2016-06-20 17:17:14
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:43:33
你没有做梯度洗脱么，可以优化一下洗脱条件，尽量分离开不同蛋白

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-06-20 17:30:04
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:44:04
层析缓冲液需要优化，层析过程也需要优化，比如梯度洗脱等。
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4楼2016-06-21 10:22:33
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了了5123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:44:34
这种柱子都有配套的说明书的，按照上面配制梯度洗脱液，然后洗脱，就能分开有标签和没有标签的
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5楼2016-06-21 14:43:13
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tmoonday

金虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:45:56
自己做梯度，咪坐浓度，40，100，150，200，250.试试，不用静置，直接洗脱，收集

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等一份缘分
6楼2016-06-23 00:10:21
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:45:31
你好，根据提供的信息给出一点建议：
1.更换填料、溶液。生工Ni-NTA 预装重力柱，1 ml 可以反复使用和再生5~10次；
2.优化方法。保留时间太久了，正常滴下来就行；梯度洗脱50、100、250、500mM咪唑。
供你参考，祝好。
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
7楼2016-06-24 17:38:28
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:44:58
哪条带是你的？如果是刚开始跑电泳，最好加上空载对照，找到目标蛋白的位置，确认大量产蛋白了。梯度纯化优化了条件以后，如果还是这样，不能排除his-tag没有接上去，或者被包裹在蛋白内部。
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8楼2016-06-25 00:49:26
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ttszero

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-25 08:46:14
his标签很麻烦的，最基础的纯化而已，不要以为可以纯得多干净，但也不至于这样子，先搞个梯度试试，剩下两三条杂带后可以用切gel的方法，his不可能纯的

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9楼2016-06-25 01:26:24
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ttszero

新虫 (小有名气)
生工的柱子太差了，起码用novagen，GE的，最好用伯乐的，柱子分得更细，杂带去得更干净，wash buffer 没几条杂带，这国产的柱子根本不行

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10楼2016-06-25 01:30:31
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